人核糖核酸酶抑制因子对胰岛素样生长因子Ⅱ的影响及其机理的研究

摘要

核糖核酸酶抑制因子(RibonucleaseInhibitor，RI)是一种胞浆内酸性蛋白质，分子量约为50KDa。RI是核糖核酸酶A(RibonucleaseA，RNaseA)的抑制剂，可以有效地抑制其对RNA的水解作用。RI也是血管生成因子(Angiogenin，Ang)的高效抑制剂。血管生成因子具有强烈的促进新生血管形成活性，而肿瘤生长与新生血管密切相关，因此Ang的存在有利于肿瘤细胞的生长。RI与Ang结合后可以抑制Ang的促血管生成活性，从而抑制肿瘤生长。RI由含有许多亮氨酸重复顺序的多肽组成，含有这样重复顺序的一百多种蛋白质显示了广泛的功能，包括细胞周期调节、DNA修复、对细胞外基质的相互作用以及抑制酶活性等。RI定位于染色体的11p15.5，同样位于此位置的胰岛素样生长因子(IGF-2)是促有丝分裂原，它不仅是通过旁分泌与自分泌形式调节细胞生长、分化、凋亡和转化的多肽，而且是信号传导通路中重要的刺激因子。上述各种过程的失衡促使细胞增殖失控，进而导致恶变。有证据证明IGF-2在许多肿瘤细胞中可使细胞增殖增加，抑制凋亡，增加局部浸润和转移。另外有研究[27]观察到IGF-2可以直接促进脐静脉内皮细胞生成Angiogenic(血管生成素)，从而促进新生血管的形成。RI与IGF-2位于人染色体同一位置附近，而具有截然相反的生理作用。故而，推测二者可能存在某种相互作用关系，并进一步探讨研究RI在信号传导中的重要生理作用，从而为RI的抗肿瘤，抗血管生成作用提供重要的理论依据。 本研究的目的在于探讨真核细胞系中过表达RI对IGF-2的影响，并进一步了解二者相互作用关系，以其阐明RI抗肿瘤、抗氧化的作用机理。本试验将人核糖核酸酶抑制因子(hRI)通过逆转录病毒载体(pLNCX-RI)经过病毒包装细胞(PA317)包装后的高滴度病毒上清，感染真核细胞：人乳腺癌(MCF-7)细胞系，经G418筛选后，使hRI在MCF-7中高表达，进而检测其对胰岛素样生长因子(IGF-2)的影响，并研究二者可能存在的相互作用关系及其作用机理。本论文的主要工作如下： 1.将人核糖核酸酶抑制因子基因的cDNA通过逆转录病毒包装细胞系PA317包装后，转染到MCF-7人乳腺癌细胞中，用转染空载体和未转染的MCF-7细胞作为对照。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫细胞化学以及细胞形态学进行鉴定，获得稳定高表达人核糖核酸酶抑制因子的MCF-7细胞株。结果显示：转染RI组RT-PCR检测到pLNCX-RI的表达，且免疫蛋白印迹显示hRI蛋白表达增强。 2.通过RT-CPR、WesternBlotting、免疫细胞化学以及细胞免疫荧光，检测试验组和对照组细胞内胰岛素样生长因子(IGF-2)在mRNA水平和蛋白表达水平的变化，以此分析人核糖核酸酶抑制因子对其影响。结果显示：转染组IGF-2基因在mRNA水平没有明显变化，而在蛋白水平和对照组比较表达量升高，且免疫细胞化学和细胞免疫荧光显示不同组间差异显著。 3.运用免疫共沉淀技术，研究二者可能存在的直接或间接相互作用关系。在SDS-PAGE电泳得到相互作用的几种蛋白，并通过WesternBlotting验证二者存在直接或间接相互作用关系。 试验结果表明转染组与转染空载体和未转染的MCF-7细胞中，稳定高表达的人核糖核酸酶抑制因子在mRNA水平上不能引起胰岛素样生长因子IGF-2的变化，而在蛋白水平使其表达量升高，并通过免疫共沉淀检测到二者的确存在直接或间接的相互作用关系。 上述结果提示RI可能通过与胞浆内的IGF-2结合，引起IGF-2在肿瘤细胞内的表达量相对升高，从而阻断其与IGF受体的结合，达到抑制某一信号传导通路，进而抑制其促肿瘤细胞增殖的功能。这些发现提示RI可能在某些组织中具有抑癌基因的功能，RI可能成为基因治疗的靶基因。今后的研究可以进一步深入研究探讨RI究竟是通过哪一条信号传导通路来达到抗肿瘤、抗氧化的功能，并可通过基因敲除和RNA干涉技术，来确定RI基因的表达与肿瘤发生的关系，以期进一步了解RI的生物学功能及其抗肿瘤的确切的分子机制，并为RI的临床应用提供有价值的实验依据和线索。

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摘要

前言

第一部分人核糖核酸酶抑制因子基因转染MCF-7乳腺癌细胞及鉴定

第二部分：人核糖核酸酶抑制因子对类胰岛素样生长因子IGF-2的影响

第三部分：免疫共沉淀检测RI与类胰岛素样生长因子IGF-2的相互作用关系

致谢

参考文献

综述胰岛素样生长因子与肿瘤研究进展

附录：Tricine-SDS-PAGE for separation of 1-1ookD proteins.