应用siRNA抑制星形细胞胶质纤维酸性蛋白基因后对GFAP表达的影响

摘要

本实验旨在经体外分离、培养来纯化获得的星形胶质细胞，并导入以胶质纤维酸性蛋白基因的不同位点为靶标的3条siRNA诱导胶质纤维酸性蛋白mRNA基因沉默，通过观察细胞形态变化及检测细胞GFAP表达改变，来分析应用siRNA技术抑制靶基因后对相关蛋白表达的影响，以期为抑制脊髓损伤后星形胶质细胞过度活化，并为进一步研究解决SCI后瘢痕过度增生、清除脊髓轴突再生障碍，从而促进神经轴突损伤修复奠定实验基础。 研究方法：分离1周内新生SD大鼠大脑皮层细胞，用含20﹪血清的DMEM/F12的培养基培养，经原代及传代培养，并以GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。待传代培养生长态势良好时，随机将其分为6组(空白对照、阳性对照、阴性对照、3种不同的siRNA各对应一组，分别为S1/S2/S3组)，进行特异性siRNA转染，转染后继续培养24小时，并对细胞形态的变化进行观察记录、应用GFAP-FITC免疫荧光法对各组AS进行检测；收集各组细胞应用Western-blotting检测GFAP的表达。 研究结果：转染后的细胞体积较空白组细胞体积减小，细胞突起减少或变短，增长趋势在一定程度上被遏制；免疫荧光法显示转染组细胞内的GFAP荧光明显较空白组减弱；Western-blotting检测表明，转染后24h星形胶质细胞的GFAP表达较空白对照组及阴性对照组明显下调(P＜0.05)。 研究结论：体外分离培养可获得纯度较高的星形胶质纤维细胞；在应用siRNA转染后，星形胶质纤维细胞的体积较转染前有所减小，胞体伸出的树突变短，数量变少，细胞增殖趋势在一定程度上得到抑制；免疫荧光检测及Western-blotting检测示细胞转染后GFAP的表达明显下调(P＜0.05)；此实验结果为进一步进行应用siRNA诱导目的基因沉默的方法来减轻脊髓损伤后修复期胶质瘢痕过度增生，从而为轴突再生清除机械屏障的研究奠定了实验基础。

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讨论

结论

致谢

参考文献

附图：

综述 脊髓中星形胶质纤维细胞的作用研究进展