小鼠CD147糖基化位点突变体在小鼠肝细胞IAR20中的表达与生物学功能初步研究

摘要

目的： 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，它参与和调控生物体的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的不断发展，蛋白质糖基化研究越来越受到广泛的重视。 CD147是高度糖基化的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族的成员。CD147是细胞表面多功能糖蛋白，广泛表达于各种细胞中，如淋巴母细胞，炎症细胞，特别在肿瘤细胞高表达。CD147主要通过诱导基质金属蛋白酶活性参与组织重构，参与许多生理和病理过程，包括精子发生、受精、神经网络形成和发育、HIV感染和肿瘤转移。 CD147由2个胞外Ig结构域，1个跨膜结构域和1个胞内结构域组成。从CD147N端起，第一个胞外Ig结构域与MMPs诱导活性及CD147自身寡聚有关；第二个胞外Ig结构域与窖蛋白（Caveolin-1，Cav-1）存在相互作用。由于N-糖基化不同，CD147同时表现为高糖型CD147（HG-CD147，分子量40-66kDa）和低糖型CD147（LG-CD147，分子量32kDa）。有文献报道，N-糖基化对CD147的诱导活性起促进作用，但CD147糖基化的功能尚有待深入研究。 本文基于本实验室已构建的野生型CD147真核表达载体，利用快速PCR定点突变的方法，构建CD147糖基化位点突变的真核表达载体，并将其稳定表达于小鼠肝正常细胞IAR20中，观察CD147的糖基化对细胞的生物学功能的影响。 方法： 1．利用快速PCR定点突变的方法，构建CD147糖基化位点突变pcDNA3．1表达载体。 2．利用脂质体将野生型CD147及其糖基化位点突变体表达载体转染至小鼠肝正常细胞IAR20细胞上，以空表达载体做对照，经G418筛选及RT-PCR和Western blot分析，获得野生型CD147及其糖基化位点突变体稳定表达株。 3．利用MTT法检测稳定表达野生型CD147及其糖基化位点突变体对IAR20细胞增殖能力的影响；利用体外基质侵袭实验，观察检测稳定表达野生型CD147及其糖基化位点突变体对IAR20细胞迁移和侵袭能力的影响。 结果： 1、限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定表明，成功构建小鼠CD147糖基化位点突变真核表达载体pcDNA3．1/CD147 （N154Q）和pcDNA3．1/CD147 （N44，154Q）。 2、Western blot和RT-PCR结果表明，pcDNA3．1/CD147WT，pcDNA3．1/CD147N154Q和pcDNA3．1/CD147N44，190Q在小鼠肝正常细胞IAR20细胞中稳定表达野生型CD147和糖基化位点突变体CD147N154Q的分子量分别为44kDa和45kDa，糖基化位点突变体CD147N44，190Q表达为两条带，分子量分别为37kDa和42kDa。 3、与转染空载体和未转染细胞相比，稳定表达野生型CD147和糖基化位点突变体CD147N154Q的IAR20细胞增殖能力和迁移能力显著增强（p<0．05），而稳定表达糖基化位点突变体CD147（N44，190Q）对IAR20细胞的增殖能力和迁移能力没有显著影响（p>0．05）。 4、与转染空载体和未转染细胞相比，稳定表达野生型CD147、糖基化位点突变体CD147（N154Q）和CD147（N44，190Q）均不增加IAR20细胞侵袭能力。 结论： CD147的稳定表达促进小鼠肝正常细胞IAR20细胞的增殖和迁移，而CD147的这种促进作用与CD147糖基化程度有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

综述 CD147的研究进展

前言

第一部分 小鼠CD147糖基化位点突变体真核表达载体的构建

第二部分 CD147糖基化位点突变体在小鼠肝细胞IAR20中稳定表达及鉴定

第三部分 CD147(wt),CD147(N154Q)及CD147(N44,190Q)蛋白对于IAR20细胞生物学功能的影响

结论

参考文献

致谢