丹参酮ⅡA微乳逆转肿瘤多药耐药的活性研究

摘要

目的：
　　 研究丹参酮Ⅱ A微乳逆转肿瘤多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)的活性及机制。
　　 方法：
　　 1.MTT法检测丹参酮Ⅱ A微乳的细胞毒作用。将顺浓度梯度的丹参酮Ⅱ A微乳作用于耐药细胞K562/ADM,作用时间48h。作用结束前4h用MTT作用于细胞,三联液终止反应,酶标仪检测吸光度。Origin软件绘制K562/ADM细胞的生长曲线,从曲线上计算丹参酮Ⅱ A微乳的无毒剂量(使95％的细胞生长的浓度,IC95)和低毒剂量(使85%的细胞生长的浓度,IC85)。
　　 2.MTT法检测丹参酮Ⅱ A微乳逆转K562/ADM细胞MDR的作用。将顺浓度剃度的多柔比星作用于K562/ADM细胞,同时加入无毒剂量的丹参酮Ⅱ A微乳和低毒剂量的丹参酮Ⅱ A微乳,分别命名为为实验组Ⅰ和实验组Ⅱ。作用细胞48h,作用结束前4h用MTT作用于细胞,三联液终止反应,酶标仪检测吸光度。Origin软件绘制和计算使50%的细胞生长的浓度(IC50)。对照组为丹参酮Ⅱ A溶液组、空微乳组,阳性对照为维拉帕米组。空白对照组只加细胞和多柔比星。另外检测了实验组Ⅰ和实验组Ⅱ72h的逆转MDR活性。逆转倍数=空白对照组IC50/实验组或对照组IC50。
　　 3.荧光分光光度计和荧光显微镜检测细胞内多柔比星。将0.17μg/ml丹参酮Ⅱ A微乳和5μg/ml柔比星作用于K562/ADM细胞,作用24h后,对细胞样品进行处理,荧光分光光度法检测细胞内多柔比星浓度。对照组为丹参酮Ⅱ A溶液组、空微乳组,阳性对照为维拉帕米组。空白对照组只加细胞和多柔比星。丹参酮Ⅱ A微乳作用下,荧光显微镜观察了不同时间点细胞内多柔比星的聚积。
　　 HPLC法检测细胞内丹参酮Ⅱ A浓度。将15μg/ml的丹参酮Ⅱ A微乳作用于K562/ADM细胞,检测不同时间点细胞内丹参酮Ⅱ A的浓度。对照组为丹参酮Ⅱ A溶液组。同时绘制标准曲线,检测专属性和灵敏度,计算提取回收率、加样回收率、日内精密度和日间精密度。
　　 5.荧光分光光度计和荧光显微镜检测细胞内罗丹明123。0.17μg/ml丹参酮Ⅱ A微乳和1μg/m1罗丹明123作用于K562/ADM细胞,作用一定时间后处理细胞样品,荧光分光光度计检测细胞内罗丹明123浓度。对照组为丹参酮Ⅱ A溶液组、空微乳组,阳性对照为维拉帕米组。空白对照组只用1μg/ml罗丹明123作用于细胞。同时用荧光显微镜观察各组细胞对罗丹明123的摄取。
　　 6.P-糖蛋白和Bcl-2蛋白的检测。0.17μg/ml丹参酮Ⅱ A微乳作用于K562/ADM细胞24h,细胞经PBS洗涤制备为细胞悬夜,分别加入PE连接的抗P-糖蛋白抗体和FITC连接的抗Bcl-2蛋白抗体,再经处理后用流式细胞仪检测荧光强度。对照组分别是丹参酮Ⅱ A溶液组和空微乳组。空白对照组为不加药物的K562/ADM细胞和K562细胞的悬夜。
　　 结果：
　　 1.丹参酮Ⅱ A微乳对K562/ADM细胞的无毒剂量和低毒剂量分别是0.11μg/ml和0.17μg/ml。
　　 2.实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的48h逆转倍数分别为12.63±1.20、20.35±1.65。对照组丹参酮Ⅱ A溶液组、空微乳组以及阳性对照组的逆转倍数分别是2.07±0.07、6.87±0.08、4.29±1.36。无毒剂量和低毒剂量的丹参酮Ⅱ A微乳72h的逆转倍数分别是16.54±1.65和25.22±0.59。说明随着作用浓度和作用时间的增加,丹参酮Ⅱ A微乳的逆转倍数是增加的。
　　 3.荧光分光光度法检测到丹参酮Ⅱ A微乳组细胞内多柔比星浓度为0.502±0.01μg/ml。对照组丹参酮Ⅱ A溶液组、空微乳组、阳性对照组的细胞内多柔比星浓度分别是0.406±0.008μg/ml、0.461±0.003μg/ml、0.551±0.010μg/ml。空白对照组细胞内多柔比星浓度为0.285+0.009μg/ml。荧光显微镜观察到经丹参酮Ⅱ A微乳处理,0-18h的范围内K562/ADM细胞内的多柔比星荧光强度随时间延长而增加。
　　 4.HPLC检测到丹参酮Ⅱ A微乳作用2h、4h、8h后,细胞内丹参酮Ⅱ A浓度分别为3.50±0.10μg/ml、4.07±0.13μg/ml、3.69±0.13μg/ml。丹参酮ⅡA溶液作用2h、4h、8h后,细胞内丹参酮Ⅱ A的浓度分别为2.84±0.01μg/ml、3.37±0.18μg/ml、3.07±0.08μg/ml。在各时间点,丹参酮Ⅱ A微乳组细胞内丹参酮Ⅱ A浓度均高于丹参酮Ⅱ A溶液组。
　　 5.荧光分光光度法检测到丹参酮Ⅱ A微乳组细胞内罗丹明123浓度为3.86±0.14μg/ml。作为对照组的丹参酮Ⅱ A溶液组、空微乳组、阳性对照组的细胞内罗丹明123的浓度分别为2.29±0.02μg/ml、3.17±0.15μg/ml、2.44±0.21μg/ml。空白对照组细胞内罗丹明123浓度为2.13±0.03μg/ml。荧光显微镜也观察到丹参酮Ⅱ A微乳组细胞内聚积有较高浓度的罗丹明123。
　　 6.流式细胞仪检测到丹参酮Ⅱ A微乳组的荧光强度为1.20。对照组丹参酮Ⅱ A组和空微乳组的荧光强度分别为2.64和1.49。空白对照组K562/ADM细胞悬夜和K562细胞悬夜的荧光强度分别是3.24和1.98。对于Bcl-2蛋白的表达水平,丹参酮Ⅱ A微乳组同其它对照组无显著性差异。
　　 结论：
　　 1.丹参酮Ⅱ A微乳具有较高逆转肿瘤MDR的活性,而且这种作用与作用时间和作用浓度呈正相关。
　　 2.丹参酮Ⅱ A微乳逆转肿瘤MDR的活性可能与其促进细胞对丹参酮Ⅱ A的摄取,抑制细胞生长和P-糖蛋白的表达,进而增加细胞内多柔比星的浓度有关。