转基因同种异体组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究

摘要

目的:应用逆转录病毒载体将外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因整合到兔关节软骨细胞的基因组中,使其获得永生化,并对其生物学特性进行研究。以基因转染得到的永生化软骨细胞为种子细胞,复合骨基质明胶(Bone Matrix Gelatin,BMG)构建组织工程软骨,对其修复兔关节软骨缺损的能力进行评价,从而探讨转入hTERT基因的永生化软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性及BMG作为软骨组织工程支架材料的优越性。
　　 方法:
　　 1.分离、培养兔关节软骨细胞并对其特有表型进行鉴定。通过阳离子脂质体将pLEGFP-C1-hTERT质粒与-pVSV-G质粒共转染GP2-293包装细胞,并对转染后72小时内收集到的病毒上清进行浓缩,再感染分离得到的第2代兔关节软骨细胞,并观察转染后GP2-293细胞和软骨细胞绿色荧光蛋白GFP的表达。使用NIH3T3细胞对病毒原液和浓缩液进行病毒滴度测定,并比较前后的变化。使用含有G418的培养液筛选被病毒浓缩液感染后的关节软骨细胞,将得到的克隆扩大培养,并采用RT-PCR法检测扩增细胞内hTERT基因的表达。扩增后的软骨细胞在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况,绘制细胞生长曲线和计算群体倍增时间来探讨转入hTERT基因对细胞增殖的影响。通过RT-PCR法和免疫组化染色来评价转入hTERT基因后软骨细胞表型的变化情况和细胞因子BMP-4对转染后软骨细胞表型的影响。最后通过平板克隆形成实验观察转入hTERT基因后对软骨细胞转化倾向的影响。
　　 2.制备兔骨基质明胶BMG,将得到的BMG修剪后冻干,环氧乙烷灭菌后置于-80'C保存备用。将永生化软骨细胞复合BMG生长,制备成细胞-载体复合物,并分别采用RT-PCR法和免疫组化法检测细胞复合BMG生长3天后Ⅱ型胶原的表达情况。8只雄性新西兰兔随机分成A、B两组,建立双侧股骨滑车关节面软骨缺损的模型,每个膝关节均有两处软骨缺损,包含实验组和对照组。A组:实验组为永生化软骨细胞复合BMG(A1),对照组为空白BMG(A2):B组:实验组为永生化软骨细胞复合BMG(B1),对照组为第2代软骨细胞复合BMG(B2).分别于术后6周和12周取材,行大体观察和Moran大体评分。
　　 结果:
　　 1.得到的兔关节软骨细胞以多角形和三角形为主,胞浆丰富,具有良好的折光性,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果均呈阳性。通过pLEGFP-C1-hTERT质粒与pVSV-G质粒共转染(3P2-293包装细胞,细胞内可见绿色荧光蛋白GFP表达,收集到的病毒上清液经浓缩后病毒滴度明显提高。浓缩病毒液感染兔关节软骨细胞72小时后见软骨细胞胞浆中有成片黄绿色荧光蛋白表达。经G418筛选4周后最终得到克隆并将其扩增,已经连续传至25代,初步建立了永生化软骨细胞系。而未经转染的第2代软骨细胞经(3418筛选1周后全部死亡。通过RT-PCR法能够检测到永生化软骨细胞的hTERT基因在mRNA水平的表达。体外连续培养中,永生化软骨细胞增殖活力提高,生长速度加快,群体倍增时间缩短,而细胞体积缩小并逐渐拉长,呈长梭形或放射状排列,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈阴性,RT-PCR法几乎检测不到Ⅱ型胶原的mRNA表达,标化后的灰度值明显低于正常第2代软骨细胞组和加入 BMP-4的永生化软骨细胞组(P＜0.05)。转入hTERT基因的软骨细胞在体外贴壁生长的过程中具有接触抑制性,克隆形成率仅为5.8％,远低于Hela细胞的克隆形成率,不具备恶性转化倾向。
　　 2.制得的BMG呈疏松多孔隙的海绵状结构,具有一定的韧性和强度,易被修剪成各种需要的形状。去分化的永生化软骨细胞复合BMG体外培养3天后,Ⅱ型胶原能够重新被翻译、表达。手术后6周和12周A1、B1、B2均由软骨样组织修复,关节面完整,修复组织与周围正常软骨整合满意,而A2软骨缺损处凹陷,其内有少量灰白色透明样物质填充,周围界限清楚。Moran大体评分结果显示在两个时间点实验组(A1、B1)、正常阳性对照组(B2)评分结果均明显优于空白BM(3对照组(A2),差异具有统计学意义(P＜0.05)。术后6周,实验组(A1、B1)及正常阳性对照组(B2)评分差异不具有统计学意义(P＞0.05);术后12周,实验组(A1、B1)优于正常阳性对照组(B2),有统计学意义(P＜0.05)。术后12周各组的得分均高于各自术后6周的得分(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.通过转入外源性hTERT基因建立了永生化软骨细胞系,关节软骨细胞在体外培养的寿命显著延长。
　　 2.永生化软骨细胞在体外单层培养的过程中表型逐渐丢失,细胞因子BMP-4可以使永生化软骨细胞的表型得到维持。
　　 3.BMG可作为种子细胞的良好载体,并可以诱导去分化的永生化软骨细胞重新分化。
　　 4.hTERT构建的永生化关节软骨细胞作为软骨组织工程的种子细胞具有可行性。