微囊化神经母细胞瘤体外诱导髓间充质干细胞定向分化为神经细胞的观察研究

摘要

目的:利用海藻酸钠微胶囊免疫隔离及选择性透过的特性,使其包裹神经母细胞瘤株,与骨髓间充质干细胞共培养,研究骨髓间充质干细胞在此特殊的生物微环境下,被诱导、分化为神经细胞的情况。
　　 方法:
　　 (1)骨髓间充质干细胞的体外培养阶段:4-6周SD雄性大鼠4只,取其双下肢股骨及胫骨骨髓,用10％FBS+L-DMEM冲洗骨髓腔,以全骨髓培养法培养细胞,每3天换液,当细胞达到80％-90％时消化传代,扩传到第五代后使用。
　　 (2)神经母细胞瘤细胞的体外培养阶段:将购买的瘤细胞解冻复苏,用1O％+1640培养细胞,每2天换液,当细胞达到80％-90％时消化传代,扩传到第五代后使用。
　　 (3)共培养阶段:先将传至第五代的神经瘤细胞进行微囊化包裹,作为诱导组。另备同等数量的瘤细胞,搅碎、滤过,取上清作为匀浆组备用。实验分组:①.空囊对照组:将1×104/cm2的骨髓间充质干细胞接种于3×10cm培养皿中,并加入空微囊。②微囊化瘤细胞诱导组:将1x104/cm2的骨髓间充质干细胞接种于3×10cm培养皿中,以1:2,1:3的细胞数目比加入已包裹好瘤细胞的微囊。③匀浆诱导组:将1x104/cm2的骨髓间充质干细胞接种于3×10cm培养皿中,将备好的上清液与神经细胞培养液按1:5,1:10混合,两组分别于3、5、7、9天取出,固定,免疫细胞化学染色。
　　 (4)在激光共聚焦显微镜下观察,选取非重叠视野计数阳性细胞数和总细胞数,结果用均数土标准差表示。应用SPSS11.0软件包进行方差分析和组间比较。
　　 结果:除空囊对照组各组细胞均发生了形态学改变,其中1:5组在第一天最明显,1:3组在第三天最明显。免疫荧光染色结果显示,1:2组在第三天Nestin阳性最多。微囊诱导组中均出现神经细胞,并呈逐渐衰亡趋势。匀浆组中同样出现Nestin及TubulinⅢ阳性,但在第五天后分别出现不同程度的肿瘤细胞样改变。
　　 结论:本实验所建立的微囊化瘤细胞诱导体系,可以诱导骨髓间充质干细胞向神经前体细胞及神经细胞分化。