Ca2+/cbl-b/AKT通路在脑缺血预处理保护机制中的作用研究

摘要

在中国,缺血性脑血管病的发病率排名世界第一,比美国高出一倍。脑卒中已经升为中国第一位死因,死亡率高于欧美国家的4-5倍。我国存活的脑卒中患者中,约有3/4不同程度地丧失了劳动能力,其中重度致残者约占40％,存在偏瘫、失语、智能低下、生活不能自理等残疾,严重影响患者的生存质量。急性脑卒中的治疗目标为限制缺血的严重性及减少缺血持续的时间,以保存缺血半暗带的低灌注区的面积,缺血瀑布理论为急性期的干预提供了治疗靶点。但急性期的治疗干预效果有限,要根本解决脑血管病造成的脑损伤,就要从脑细胞对缺血应激损伤的适应机制上干预治疗。
　　 在本研究中,采用了大脑中动脉栓塞法制作了SD大鼠脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIPC)模型,并给予Ca2+调节剂的干预,观测了各组大鼠海马神经元内Ca2+浓度的变化,检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况。评价了神经功能缺损评分及脑组织的梗死体积;应用Western blotting检测Ca2+信号传导通路上的神经钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)、B系淋巴瘤-b(Casitas B-celllineage lymphoma-b,cbl-b)及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated proteionkinasep B,p-AKT)的蛋白表达,RT-PCR检测cbl-b的转录。以进一步探讨Ca2+信号传导通路在CIPC中的作用机制,及脑神经保护的机制。
　　 目的:
　　 1.SD大鼠实验模型制备采用的是局灶性大脑中动脉栓塞法,在本实验中探讨了实验方法的改进,以提高实验的成功率。
　　 2.采用TUNEL凋亡检测法检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况,以明确经CIPC及Ca2+调节剂干预后神经元凋亡的情况。
　　 3.应用激光扫描共聚焦显微镜检测各组大鼠海马神经元内Ca2+浓度变化情况,已明确CIPC及Ca2+调节剂干预后神经元内Ca2+的浓度变化。
　　 4.评价各组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积,以明确CIPC及各种Ca2+调节剂对大鼠神经功能缺损及脑梗死体积的影响。
　　 5.应用Western Blot技术检测海马神经元内凋亡相关蛋白CaN、cbl-b及ANT、p-AKT的蛋白表达情况,进一步探讨凋亡相关蛋白在CIPC中的表达变化情况及如何调整神经元的存亡。
　　 6.采用RT-PCR技术检测海马神经元内cbl-b的转录变化情况,进一步探讨CIPC对神经元的凋亡的干预是否是从转录水平参与调控的。
　　 方法:
　　 第一部分:大鼠大脑中动脉栓塞(the occlusion of cerebral middle artery,MCAO)模型制备的改进
　　 参考Koizumi线栓方法及焦卓敏局灶缺血模型的方法,做出以下几个方面的调整:1)采用颈部正中偏右侧的手术切口,2)根据大鼠的体重为200-250g,选择的线栓直径为0.26mm,3)应用统一购买的成品线栓,制备CIPC模型,脑缺血模型及假手术模型,并依据是否出现Homor征、bederson神经功能缺损评分及TTC染色判定模型制备是否成功。
　　 第二部分:各组大鼠海马神经元内游离Ca2+及凋亡神经元的检测
　　 1.试验动物分组雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、脑缺血组、CIPC组、尼莫地平+CIPC组(尼莫地平组)组、MK801+CIPC组(MK801组),共5组。
　　 2.采用寡核苷酸末端脱氧核糖转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠右侧海马凋亡阳性神经元。
　　 3.各组大鼠在预定时间断头取脑后,经分离海马神经元、荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜检测,计算出不同组大鼠的海马神经元内游离Ca2+平均荧光像素值,进行海马神经元游离Ca2+的检测。
　　 第三部分:各组大鼠海马神经元内CaN、cbl-b、ANT及p-ANT的蛋白表达
　　 1.雄性健康SD大鼠108只,随机分为假手术组、脑缺血组、CIPC组、尼莫地平+CIPC组(尼莫地平组)组、MR80l+CIPC组(MK801组)、环孢素A+CIPC组(环孢素A组)组共6组,每组18只。
　　 2.采用bederson法评价各组大鼠的神经功能缺损情况及应用TTC染色进行脑梗死体积比较。
　　 3.各组大鼠在预定时间点断头取脑,采用RT-PCR及Western Blot检测cbl-b的转录及CaN、cbl-b、ART及p-ANT的蛋白表达。
　　 结果:
　　 第一部分
　　 1.各组大鼠神经功能缺损评分假手术组神经功能缺损评分均为0分。脑缺血组神经功能缺损评分最高,与脑缺血组比较,CIPC组评分降低明显(P＜0.05)。
　　 2.各组大鼠脑梗死体积假手术组基本无脑梗死病灶。脑缺血组脑梗死体积最大,CIPC组梗死体积减小明显(P＜0.05)。
　　 第二部分
　　 1.神经元内的游离Ca2+的变化情况缺血组及MK801组大鼠的海马神经元相对荧光像素值最高,两组间差异无统计学意义(P＞0.05);与脑缺血组比较,CIPC组的相对像素值明显减低(P＜O.05);与CIPC组比较,尼莫地平组的相对像素值降低(P＜O.05)。2.神经元的凋亡情况假手术组神经元凋亡最少;缺血组及MK801.组凋亡的神经元数最多,两组间差异无统计学意义;CIPC组的神经元凋亡数明显减少,与缺血组比较差异有统计学意义(P＜0.05);尼莫地平组的海马神经元凋亡较CIPC组明显减少,差别有显著的统计学意义(P＜O.01)。
　　 第三部分
　　 1.神经功能缺损评分脑缺血组及MK801组神经功能缺损评分最高,与脑缺血组比较,CIPC组、尼莫地平组及环孢素A组评分降低明显,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);尼莫地平组与环孢素A组评分最低,与CIPC组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);但环孢素A组与尼莫地平组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 2.脑梗死体积比较脑缺血组及MK801组脑梗死体积最大,CIPC组、尼莫地平组及环孢素A组梗死体积减小明显,与脑缺血组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);尼莫地平组与环孢素A组梗死体积最小,与CIPC组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),但环孢素A组与尼莫地平组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3.CaN、cbl-b、AKT及p-AKT的蛋白表达假手术组大鼠CaN、cbl-b蛋白表达极少,与假手术组比较,其他各组大鼠CaN、cbl-b蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。脑缺血组及MK801组大鼠CaN、cbl-b蛋白表达最高,与脑缺血组比较,CIPC组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。与CIPC组比较,尼莫地平组及环孢素A组降低明显,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。但尼莫地平组与环孢素A组比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。在各组中,AKT的蛋白表达没有差异。脑缺血组的p-AKT的蛋白表达最低,MK801组与脑缺血组比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。CIPC组、尼莫地平组及环孢素A组的p-AKT蛋白表达增高,与脑缺血组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。尼莫地平组及环孢素A组的p-AKT蛋白表达明显升高,与CIPC组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。但尼莫地平组与环孢素A组比较,差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　 4.cbl-b mRNA转录的变化脑缺血组及MK801组均增加了cbl-b的mRNA水平的转录,两组间差异无统计学意义(P＞0.05);在脑缺血前给予亚致死量的CIPC,降低了cbl-b的转录,较脑缺血组,差异有统计学意义(P＜0.05);尼莫地平组及环孢素A组更加降低了cbl-b在mRNA水平的表达,与CIPC组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);但与尼莫地平组比较,没有转录水平的差异(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 第一部分
　　 1.采用颈部正中偏右侧手术切口,线栓直径调整为0.26mm,统一购买线栓明显缩短了手术的时间,提高了线栓介入的成功率,减小了大鼠损伤率,提高了MCAO模型制备成功率。
　　 第二部分
　　 1.CIPC可适量增加神经元内Ca2+浓度,减少海马神经元的凋亡,产生神经保护作用。
　　 2.CIPC前给予MK801,抵消了CIPC的保护作用,最终使海马神经元内Ca2+浓度升高,增加了海马神经元的凋亡。
　　 3.CIPC前给予尼莫地平可明显降低神经元内Ca2+浓度,减轻海马神经元的凋亡,对神经保护有叠加作用。
　　 第三部分
　　 1.持续性脑缺血时,细胞内的过量Ca2+作用于钙调蛋白,增加了CaN的表达,在核内促进了cbl-b基因的转录,增加了cbl-b的表达,增强的cbl-b泛素化了PI3K的P85亚基,使PI3K的含量降低,减少了AKT的磷酸化表达,促进了凋亡的发生。
　　 2.CIPC抑制了这一过程,减少了CaN及cbl-b的表达,增加了p-AKT的表达,减少神经元的凋亡。
　　 3.尼莫地平通过降低神经元内Ca2+浓度,环孢素A抑制了CaN的活性,进一步减少CaN及cbl-b的表达,增加p-AKT的表达。
　　 4.MK801抵消了CIPC的神经保护作用,使其在脑缺血时达到了钙超载,增加CaN及cbl-b的表达,抑制p-AKT的表达,促进了细胞的凋亡。