雌激素上调结肠癌细胞SW480及胚肾细胞293T HMLH1表达并增强细胞微卫星稳定性

摘要

目的:流行病学研究表明，结肠癌患者男性多于女性。绝经后妇女的雌激素替代治疗可在一定程度上降低结肠癌的患病率和死亡率。雌激素对结肠癌可能有一定的预防作用。大部分的遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC）是由DNA错配修复(mismatchrepair，MMR)基因种系突变引起的，而散发性大肠癌中有10％-15％是由MMR基因引起的。MMR功能障碍导致的结直肠癌多数表现为微卫星不稳定(microsatelliteinstability，MSI)。有研究报导绝经后雌激素替代治疗能降低MSI阳性结肠癌风险，因此推测雌激素可以预防MMR功能缺陷引起的结直肠癌。在前期的研究中，我们发现雌激素可增加MMR的表达量，并建立了一种能定量检测体外活细胞MMR功能的体系。本研究在前期研究的基础上，进一步探讨雌激素增加MMR的表达是否会提高错配修复功能，以及这种作用能否改变基因组微卫星的稳定性从而预防结肠癌的发生。
　　 方法:设计并构建针对人错配修复基因hMLH1的shRNA真核表达质粒载体，并命名为pGPU6/GFP/Neo-MLH1-homo-234。培养结肠癌细胞株SW480细胞及胚肾细胞株293T细胞，用转染试剂vigofect将质粒pGPU6/GFP/Neo-MLH1-homo-234及阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-NC分别转染细胞SW480及293T，G418筛选阳性克隆制备稳定转染细胞株。Westemblot检测敲低效率。一定浓度（具体浓度）的雌激素处理干扰组及对照组细胞，并观察雌激素处理前后hMLH1表达量及微卫星稳定性的变化。
　　 结果:成功构建质粒pGPU6/GFP/Neo-MLH1-homo-234，转染入细胞后成功筛选阳性克隆。得到稳定转染pGPU6/GFP/Neo-MLH1-homo-234及pGPU6/GFP/Neo-NC的SW480及293T细胞。Westernblot检测沉默效率明显。干扰组微卫星状态变化为微卫星不稳定(MSI)。经雌激素处理后的干扰组hMLH1基因表达量明显上调，且微卫星水平恢复为稳定(microsatellitestability，MSS)。
　　 结论:SW480及293T细胞错配修复基因hMLH1沉默后表现为微卫星不稳定;而沉默后经雌激素处理后hMLH1表达量提高，微卫星状态为稳定。说明雌激素可上调hMLH1的表达，并提高错配修复基因功能。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 shMLH1稳定细胞株的制备

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 pGPU6／GFP／Neo- MLH1-homo-234 表达载体转染结肠癌SW480细胞及胚肾293T细胞后对h MLH1表达量的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分 雌激素处理hMLH1敲低的稳定细胞株SW480和293T后细胞蛋白及微卫星水平的检测

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢