甲基化对鳞癌细胞中岩藻糖基转移酶Ⅳ基因表达的调控及对细胞增殖影响的研究

摘要

一、目的：
　　 细胞表面的糖蛋白或糖脂是细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质之间传递信号的纽带，参与各种生理、病理过程的调控。糖蛋白和糖脂上的寡糖链是其行使功能的重要组成部分。其中，Lewis寡糖如Lewisa(Lea)、sLewisa(sLea)、Lewisb(Leb)、LewisX(LeX)、sLewisX(sLeX)和LewisY(LeY)是寡糖中的一类。这些寡糖链上都含有岩藻糖分子(Fucose)。LeY寡糖是一个含有双岩藻糖分子的寡糖[Fucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R]。在上皮来源的肿瘤中，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌等，LeY的表达水平异常升高并且与肿瘤的增殖、浸润、转移潜能密切相关。
　　 岩藻糖基转移酶（fucosyltransferases，FUTs）催化糖蛋白和糖脂上岩藻糖链的合成。其中，岩藻糖基转移酶Ⅳ(FUT4)是合成LeY的关键酶，定位于高尔基体上。在某些癌中，如结肠癌、急性髓系白血病、卵巢癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，FUT4的表达水平明显升高。文献的报道及本课题组前期工作表明，通过调控FUT4和LeY的表达水平可以调控细胞的增殖。FUT4在肿瘤组织和正常组织中的表达水平明显有差异，但调控这种表达差异的原因还不清楚。
　　 越来越多的研究表明:肿瘤的发生发展过程和某些基因的异常甲基化所引起的异常表达有关。DNA甲基化是哺乳动物基因组最常发生的表观遗传学事件，常发生在CpG二核苷酸高频率出现的CpG岛区。肿瘤中某些基因（如R-Ras、S100A4、PRAME和p-Cadherin）的低甲基化、高表达与肿瘤的增殖、浸润和转移等恶性程度有关。
　　 本文分析了具有不同增殖能力的细胞系A431和SCC12中岩藻糖基转移酶的表达水平，并在此基础上探讨FUT4表达水平与启动子的甲基化状态的关系及DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC对鳞癌细胞增殖和迁移能力的影响。
　　 二、方法：
　　 1.采用MTT、Westernblot比较分析鳞癌细胞系A431和SCC12的增殖能力。
　　 2.采用Real-timequantitativePCR、凝集素免疫印迹(Lectinblot)检测A431和SCC12两种细胞中FUTs表达水平及糖蛋白岩藻糖化水平。
　　 3.采用RT-PCR、Westernblot、间接免疫荧光、流式细胞术检测A431和SCC12两种细胞中FUT4表达水平。
　　 4.采用Westernblot、流式细胞术、间接免疫荧光检测A431和SCC12两种细胞中LeY表达水平。
　　 5.采用甲基化引物设计软件(Methprimer，http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html)对FUT4启动子区是否存在CpG岛进行预测，并设计甲基化特异性PCR和重亚硫酸盐测序PCR引物。
　　 6.采用甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR，MSP)和重亚硫酸盐测序PCR(BisulfitesequencingPCR，BSP)检测FUT4启动子区的甲基化情况。
　　 7.采用BSP对DNA甲基转移酶抑制剂(5-aza-dC)处理后细胞的FUT4启动子区的甲基化情况进行检测。
　　 8.采用RT-PCR、Real-timequantitativePCR、Westernblot检测5-aza-dC处理细胞后FUT4表达变化。
　　 9.采用间接免疫荧光、流式细胞术检测5-aza-dC处理细胞后LeY表达变化。
　　 10.采用MTT检测5-aza-dC对细胞增殖的影响。
　　 11.采用流式细胞术检测5-aza-dC处理前后细胞周期的变化。
　　 12.采用脂质体转染技术将FUT4-siRNA转染入两种细胞中，通过细胞记数法检测FUT4-siRNA、5-aza-dC与FUT4-siRNA联合使用对两种细胞增殖能力的影响。
　　 13.采用细胞划痕方法，观察5-aza-dC、FUT4-siRNA及两者联合使用对两种细胞迁移的影响。
　　 三、结果：
　　 （一）A431和SCC12细胞的增殖能力、FUTs表达水平及糖蛋白岩藻糖化水平的比较研究
　　 1.MTT、Westernblot实验结果表明:A431细胞的增殖能力明显高于SCC12细胞的增殖能力。
　　 2.Real-timequantitativePCR实验结果表明:FUTs在两种细胞中都有表达，所有检测的FUTs(FUT1-9)在A431中的表达水平均高于在SCC12中的表达水平。
　　 3.凝集素印迹实验结果表明:A431细胞中糖蛋白的岩藻糖化水平比SCC12细胞中糖蛋白的岩藻糖化水平高。
　　 （二）甲基化对FUT4基因表达影响的研究
　　 1.根据（一）的实验结果，即:增殖能力强的A431细胞中FUT4表达水平比增殖能力弱的SCC12细胞明显升高。本部分采用RT-PCR、Westernblot、流式细胞术、间接免疫荧光进一步分析。结果表明:FUT4在A431中的表达水平明显高于在SCC12中的表达。
　　 2.Westernblot、流式细胞术实验结果表明:A431细胞中LeY的表达水平明显高于SCC12细胞中的表达水平。
　　 3.通过甲基化引物设计软件，预测到FUT4启动子区有两个CpG岛。
　　 4.MSP和BSP实验结果表明:SCC12细胞中FUT4启动子区的甲基化程度明显高于A431细胞中FUT4启动子的甲基化程度。
　　 5.5-aza-dC作用细胞后，SCC12细胞中的FUT4启动子区的甲基化水平明显降低，A431细胞中FUT4启动子甲基化程度未见明显变化。
　　 6.5-aza-dC作用细胞后，SCC12细胞中的FUT4和LeY的表达显著升高，但A431细胞中的表达未见明显变化。
　　 （三）5-aza-dC对鳞癌细胞增殖和迁移影响的研究
　　 1.5-aza-dC明显抑制了鳞癌细胞A431和SCC12的增殖，使细胞阻滞在S期。
　　 2.FUT4-siRNA对A431和SCC12细胞的增殖有显著抑制作用。
　　 3.FUT4-siRNA与5-aza-dC联合使用对细胞增殖的抑制能力比单独使用强。
　　 4.5-aza-dC对A431和SCC12细胞的迁移有抑制作用。
　　 5.FUT4-siRNA对A431和SCC12细胞的迁移有显著抑制作用。
　　 6.FUT4-siRNA与5-aza-dC联合使用对细胞迁移的抑制作用比单独使用强。
　　 四、结论：
　　 （一）通过对A431和SCC12细胞的增殖能力、FUTs基因表达水平和糖蛋白岩藻糖化水平的分析，发现增殖能力较强的A431细胞中FUTs表达水平和糖蛋白岩藻糖化水平均比增殖能力较弱的SCC12细胞高。提示:FUTs基因表达水平和糖蛋白岩藻糖化水平与鳞癌细胞的增殖能力有关。
　　 （二）通过FUT4表达水平及启动子甲基化程度分析，发现A431细胞中FUT4表达水平高，启动子低甲基化。SCC12细胞中FUT4表达水平低，启动子高甲基化。5-aza-dC能够抑制SCC12细胞中FUT4启动子的甲基化从而提高FUT4的表达，而对A431细胞中已经处于低甲基化的FUT4启动子的甲基化状态作用不明显。提示:两种细胞中FUT4启动子不同的甲基化程度是这两种细胞中FUT4表达明显差异的一个重要因素，并可影响A431和SCC12细胞的增殖能力。
　　 (三)DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC对鳞癌细胞的增殖和迁移有抑制作用。通过FUT4-siRNA转染，下调FUT4基因表达，可抑制鳞癌细胞的增殖和迁移。5-aza-dC和FUT4-siRNA联合使用对细胞增殖和抑制作用增强。提示:对于FUT4表达水平高的鳞癌，可以采用5-aza-dC和FUT4-siRNA联合应用的方式，本研究为临床鳞癌的治疗提供理论依据和新的思路。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 A431和SCC12细胞的增殖能力、FUTs表达水平及糖蛋白岩藻糖化水平的比较研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 甲基化对FUT4基因表达影响的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 5-aza-dC对鳞癌细胞增殖和迁移影响的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢