棕榈酸诱导L02细胞胰岛素抵抗过程中线粒体功能变化及机制研究

摘要

目的:糖尿病是全球范围内日益严重的公共健康问题。以胰岛素信号受损为表现的胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes melluts，T2DM)的发病基础和根本原因。肝脏是胰岛素的主要靶点之一，是维持血糖稳态的主要器官，因此，肝脏IR对T2DM的发生、发展有着重要的影响。饱和脂肪酸棕榈酸(palmitic acid，PA)能够诱导肝细胞胰岛素抵抗，但确切机制尚不完全清楚。众多研究认为，线粒体功能缺失可能是其重要机制之一。线粒体是细胞内ATP产生的主要部位，脂肪酸氧化降解的主要场所。当过量的脂肪酸进入线粒体，势必产生大量的递氢体参与呼吸链电子传递。破坏线粒体的氧化还原平衡，造成线粒体能量生成障碍，与此同时，引起细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量产生。ROS既是机体的第二信使，又是触发细胞内氧化应激的重要因子，作用于蛋白质，脂类等，引起激素信号的改变，造成糖脂代谢的紊乱。但是，PA诱导肝细胞IR过程中，线粒体功能的动态变化与胰岛素信号变化间的具体机制还未完全清楚。因此，本实验旨在通过利用PA诱导正常人L02肝细胞建立IR的体外模型，观察L02细胞IR形成过程中线粒体功能及胰岛素信号通路的动态变化，探讨PA诱导的肝细胞IR形成的关键机制，寻找治疗及干预胰岛素抵抗的新靶点。
　　 方法:L02细胞常规培养，至对数生长期后，将细胞随机分为空白组、0.5％BSA溶剂对照组，PA0.125mM组、0.25mM组、PA0.5mM组培养24h，MTT法检测细胞存活率，判断最适PA浓度。根据结果，选取PA0.25mM作为实验PA浓度，取对数生长期细胞，随机分为溶剂对照组、PA8h组、PA16h组、PA24h组，根据检查指标的不同，给予相应处理。检查指标:(1)蒽酮法检测不含胰岛素及胰岛素刺激的细胞内糖原含量。(2)葡萄糖氧化酶法检测无胰岛素及胰岛素刺激12h的上清中葡萄糖消耗量。(3)油红染色法检测细胞内脂质沉积。(4)生物化学发光法检测细胞内总(adenosine triphosphate，ATP)生成，荧光分光光度法检测细胞内ROS含量及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)。(5)Western Blot法检测线粒体PKCε、UCP2、p-JNK/t-JNK、p-IRS-1/t-IRS-1、p-AKT/t-AKT蛋白水平。
　　 结果:
　　 (1)不同浓度PA处理细胞存活率不同
　　 与对照组相比，低浓度PA0.125mM，0.25mM孵育24h，细胞存活率没有明显差异;PA0.5mM处理24h细胞存活率显著下降(P＜0.001)，提示，显示低浓度PA对细胞生存没有影响。
　　 (2)PA对L02细胞胰岛素敏感性及脂质沉积的影响
　　 基础状态下，各组糖原合成，葡萄糖消耗没有明显差异。胰岛素处理后，与对照组基础状态相比，对照组糖原合成，葡萄糖的消耗均显著增加;PA0.25mM处理8h，16h胰岛素刺激的糖原合成，葡萄糖消耗与基础状态下对照组相比均明显增加，但比胰岛素刺激的对照组增加幅度低;随着PA作用时间的增加，细胞的胰岛素敏感性降低，当PA孵育24h，检测到糖原合成及葡萄糖消耗与基础状态相比均无明显改变。油红染色显示，对照组未观察到脂质沉积，PA0.25mM8h可以观察细胞有少量脂质沉积;随着PA作用时间的增加，细胞的脂肪沉积明显增加，PA处理24h，观察到细胞内有大量的脂质沉积。
　　 (3)线粒体功能改变
　　 线粒体功能指标显示，与对照组相比，ROS在PA8h即检测到明显增加(P＜0.001)，随着PA作用时间的延长细胞内ROS量持续增加，ROS在PA处理24h增加最显著(P＜0.001)，在这个范围内，细胞内ROS的增加表现出时间依赖性。与对照组相比，ATP，MMP在PA处理8h无明显变化;ATP及MMP在16h均明显减少;二者在24h减少更加显著。以上结果显示ROS变化早期出现，先于线粒体其他功能指标的改变。
　　 (4)线粒体PKCε，UCP2含量改变
　　 与对照组相比，PA处理8h，PKCε线粒体含量即有增加，差异无统计学意义;PA作用16h及24h增加显著。与对照组比较，UCP2在PA8h含量增加最显著(P＜0.05);PA处理16h、24h，UCP2含量较8h有所减少，与对照组相比差别无统计学意义。
　　 (5)胰岛素信号通路蛋白磷酸化水平改变
　　 与对照组相比，PA8h组JNK磷酸化水平显著增加(P＜0.05);JNK磷酸化水平的改变随PA作用时间的延长而增加，16h，24h增加更显著。与对照组相比，在作用PA24h出现IRS-1丝氨酸307的磷酸化水平增加。与对照组相比，PA处理8h观察到细胞内AKT丝氨酸473磷酸化水平的减少(P＜0.05);PA16h、24h与8h相比，差异无统计学意义。结果提示JNK磷酸化水平的改变与胰岛素信号改变相关。
　　 结论:
　　 (1)PA处理24h诱导了L02肝细胞胰岛素抵抗。
　　 (2)PA诱导的L02细胞IR过程中，ROS增加最早出现，导致线粒体功能降低及JNK磷酸化水平增加并最终形成胰岛素抵抗。提示ROS可能是PA诱导的L02细胞IR形成的始动因素。
　　 (3)PA诱导的L02细胞IR过程中，ROS增加，诱导PKCε线粒体转位增加。

目录

声明

摘要

第一部分 PA诱导L02细胞胰岛素抵抗模型的建立

前言

材料与方法

一、实验细胞

二、主要仪器

三、主要试剂

四、实验方法

五、实验步骤

六、统计学处理

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 PA诱导L02细胞胰岛素抵抗过程中线粒体功能及胰岛素信号改变

前言

材料与方法

一、实验细胞

二、主要仪器

三、主要试剂

四、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢