临床应用PRP制备方法的比较研究

摘要

目的:用对兔脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)增殖的影响来验证Tubex和传统二次离心法制各自体富血小板血浆(platelet-richplasma，PRP)各自生物学效应，来探讨一种安全、快速、高效制备PRP的方法。
　　 方法:1.选用新西兰大白兔，雄性，取兔附睾部区脂肪垫，Ⅰ型胶原酶消化法培养兔ADSCs，并观察细胞形态特征。
　　 2.选取P4第4代ADSCs进行成脂、成骨诱导分化及染色来鉴定ADSCs。
　　 3.PRP的制备采用兔心脏穿刺抽血，二次离心的方法，并行血小板计数及血小板回收率的计算。
　　 4.将第4代细胞分为空白组（完全培养基180μl+单纯DMEM培养基20μl）;对照组（细胞180ul+单纯DMEM培养基20ul）、全血组(细胞180ul+全血血浆20ul)、Tubex制备的PRP组（细胞180ul+PRP20ul）、传统二次离心法制备的PRP组（细胞180ul+PRP20ul）。采用CCK-8法(Cell-CountingKit-8)检测不同作用时间(24h、48h、72h)各组对ADSCs增殖活动的影响。
　　 5.将全血、Tubex制备的PRP及传统二次离心法制备的PRP采用双抗夹心法(ELISA)检测其中血小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfacto，PDGF-AB)的浓度。
　　 结果:1.原代细胞提取后镜下观其形状为圆形、大小不等。培养24小时后可见有少量的细胞贴壁形状为不规则细长型，可有像伪足一样的突起。3天后镜下观大量细胞已经贴壁生长，形状为比较细的长梭形，细胞开始增大并可见核分裂相，梭形细胞逐渐增多。5天后细胞的密度明显增加，呈现出团簇状、并向各个方向伸展形成集落，大小不一，多为长梭形。细胞融合在80％-90％时即可胰酶传代。
　　 2.成骨诱导三周茜素红染色呈阳性，成脂诱导两周油红O染色呈阳性，
　　 3.全血血小板计数为（260.2±96.8）×109/L;传统二次离心法提取的PRP血小板计数为(1508.8±557.0)×109/L;Tubex提取的PRP血小板计数为(3140.0±291.5)×109/L。Tubex制备的PRP血小板计数是全血的12.06倍，是传统二次离心法制备的PRP的2.08倍
　　 4.按血小板回收率计算公式计算Tubex制备的PRP和传统二次离心法制备的PRP的回收率，结果:Tubex制备的PRP血小板回收率为82.86％，传统方法回收率为72.54％。
　　 5.CCK-8法显示Tubex提取的PRP与传统二次离心法提取的PRP对ADSCs有明显的增殖作用。Tubex提取的PRP组在与传统组比较，其差异有显著地统计学意义(P＜0.01)。
　　 6.PRP中血小板源性生长因子PDGF-AB的浓度采用ELISA法检测，结果显示:Tubex制备的PRP中PDGF-AB的浓度明显高于传统二次离心法制备的PRP及全血PDGF-AB的浓度，其差异均有显著地统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论:1.提取兔附睾部区脂肪垫分离培养的细胞，经诱导分化并染色鉴定证实为ADSCs。
　　 2.通过Tubex和传统二次离心法成功提取兔PRP，经血小板计数及ELISA法检测其中血小板生长因子PDGF-AB的浓度，证实Tubex是一种更加快速、安全、高效制备PRP的方法。
　　 3.Tubex制备的PRP与传统方法制备的PRP相比，能够更加高效，快速的促进ADSCs的增殖。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．材料

1．1 实验动物

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

1．4、主要试剂及配制

2．实验方法

2．1 兔脂肪来源干细胞的分离与培养

2．2 PRP的制备

2．3 兔脂肪来源干细胞的增殖实验(CCK-8法)

2．4 双抗体夹心(ELISA法)检测PDGF-AB的浓度

结果

1 原代及传代细胞形态

2 ADSCs诱导染色

3 全血和PRP血小板计数结果

4 血小板回收率计算结果

5 兔ADSCs增殖实验的结果

6 双抗体夹心(ELISA)检测PDGF-AB浓度的结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢