自体脂肪干细胞经颈内动脉移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

摘要

目的:证实ADSCs经颈内动脉移植入急性脑缺血大鼠脑内，能否存活并迁移至脑缺血周边区域(IBZ)，分化为神经元，并改善脑缺血后的神经功能。同时探讨ADSCs参与脑缺血治疗的可能机制。
　　 方法:从健康成体SD大鼠附睾周围脂肪中获取ADSCs并在培养液中培养，行细胞鉴定，体外CM-Dil染色。30只大鼠用于制作一过性（1.5小时）MCAo模型。大鼠在MCAo建模成功后第3天接受ADSCs移植，第28天处死取脑。动物实验组包括:(1)经颈内动脉注入生理盐水组（盐水组）(n=10);(2)经颈内动脉移植ADSCs组（ADSCs组）(n=10);(3)不予处理的MCAo大鼠组（空白组）(n=10);免疫荧光染色用于识别体内ADSCs的分布及表达;组织学及免疫组织化学用于观察解剖病理学及量化缺血区体积。建模前所有动物接受行为学检测(mNSS评分)，TUNEL法用于评价组间IBZ区的凋亡。
　　 结果:1.mNSS评分:MCAo建模前各组的行为检测没有显著差异(P＞0.05）;移植前后不同时间点之间的差异有统计学意义(P＜0.01);ADSCs组、盐水组、空白组均如此（P＜0.01）;各组多重比较结果显示，ADSCs组和盐水组，ADSCs组和空白组间的差异有统计学意义(P＜0.01);而盐水组和空白组间的差异没有统计学意义(P＞0.05);所用动物在缺血后三天表现为严重的行为缺损，此后直至28天随着时间推移行为缺损表现为进展性下降，然而在MCAo后4天起ADSCs组较表现为明显的神经功能改善(P＜0.05).2.MCAo28天后梗死区域体积为ADSCs组:35.5％±11.9％;盐水组36.9％±9.1％;空白组36.3±9.1％(P＞0.05)。3.组织学及IHC染色结果:所有大鼠大脑皮层及纹状体缺血核心区域几乎完全缺失实质细胞免疫反应(NeuN，GFAP)，在各组大鼠的IBZ区可以明显看到组织水肿，变性，结构变形，损伤及相对完整细胞。4.激光扫描共聚焦显微镜观察所见:每只大鼠平均每5张组织切片(50-um间距)中可查见CM标记的ADSCs(17824±3624)个，病灶同侧半球的ADSCs(21853±3225)明显多于对侧半球(119±28，p＜0.05)。免疫荧光双重染色显示:每只大鼠平均每5张组织切片的总计CM标记的ADSCs(22000±663)中，大约(3.3±1.6％)ADSCs表达GFAP（箭头），(1.5±0.8％)ADSCs表达NeuN(neurons)。5.在荧光显微镜示:在ADSCs组，CM标记细胞主要分布于MCA支配的缺血区域，主要分布于同侧半球的皮质前囟层面(-1，+1)及纹状体纵轴的多个区域。更多CM标记的ADSCs(～90％)位于缺血同侧核心区及IBZ区。6.IHC染色显示，ADSCs组GFAP表达明显低于其他两组，说明移植ADSCs可以减少脑缺血诱导的胶质化反应;TUNEL染色观察到ADSCs治疗可明显减少缺血区周围的细胞凋亡数量;IHC染色也观察到ADSCs组的BrdU阳性细胞数量较对照组明显增多。
　　 结论:1.ADSCs经颈内动脉移植后可存活并迁移至脑缺血周边区域(IBZ)。
　　 2.ADSCs可部分分化为具有神经表型的类神经细胞。
　　 3.ADSCs移植可明显改善脑缺血后的神经功能缺损。
　　 4.ADSCs移植组较其他对照组可显著减少星形胶质细胞反应活动，表现较少细胞凋亡，诱导内源性细胞增殖。
　　 5.ADSCs其可能的治疗机制为:神经保护及神经再生机制:ADSCs可促进脑缺血后SVZ及SGZ的神经前体细胞增殖，加速新生的成神经细胞迁移至IBZ，抑制胶质细胞增生，减少凋亡，并增加这些细胞向成熟神经元的分化。其可作为脑缺血后可行的细胞治疗手段。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2．主要试剂及药品

1．3．主要仪器

2 实验方法

2．1 细胞培养及鉴定

2．2 自体移植前的ADSCs标记

2．3 MCAO模型建立及动物分组

2．4 ADSCs移植

2．5 行为学测试

2．6 组织学及免疫组化评估

2．7 TUNEL

2．8 量化

3 统计分析

结果

1 ADSCs鉴定

2 神经功能评分结果

3 梗死区域体积

4 组织学及免疫组化结果

5 ADSCs在受体中的识别

6 ADSCs移植可减少星形胶质反应，减少细胞凋亡，诱导内源性细胞增殖

讨论

结论

参考文献

综述

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢