Investigation into the Functional Significance of Precusor Messenger Rna Processing Factor 19(Prp19)gene Upregulation in Human Lung Adenocarcinoma

摘要

目的:癌症是由于细胞异常(增)(殖)而引起的。癌症细胞可以通过血管和淋巴管由原发部位向远端侵袭，如果这种侵袭无法被抑制则最终会导致死亡。肺癌是高发的癌症之一，其每年的全球致死率都名列前茅。肺腺癌是肺癌的一种常见类型，其发病率大约占40％。然而，早期诊断和有效的治疗并不能完全将其根治。因此，如果能从新的方向入手，找到特异性的靶点，将会为其治疗带来新的曙光。
　　信使RNA前体加工因子19(PRP19)编码一个55kDa的蛋白PRP19。该蛋白广泛存在于细胞核和细胞质。PRP19在原核和真核细胞中分别位于NineTeen复合物(NTC)和PRP19/Cdc5复合物中，能够与其他蛋白如细胞分裂循环5样蛋白(Cdc5L)、Werner综合征RecQ解旋酶样蛋白(WRN)和剪接体相关蛋白因子27(Spf27)相互作用。PRP19的功能主要有:(1)mRNA剪接，(2)泛素化，(3)DNA损伤修复，(4)转录延伸和(5)维持细胞核网络结构。
　　PRP19参与多种疾病及癌症的发生。例如，某些与泛素蛋白酶活性缺失相关的癌症的发生以及因异常剪接突变而改变基因E3连接酶活性而导致的癌症等。这些改变会导致多条重要的信号通路调节异常、关键的细胞周期蛋白调节因子功能退化而使癌蛋白功能(增)强，同时也会使其他细胞生长调控因子如NF-κB、C-Myc，N-Myc和Src样蛋白功能异常。此外，上述异常同样会引起肿瘤抑制蛋白如p53和p27的退化。在体外，PRP19表达上调具有多种积极的作用，包括抗衰老和延长生命周期。这些特性取决于PRP19的DNA损伤修复能力。PRP19在体外的上调表达会(增)加其对凋亡的耐受能力，同时会(增)加p53的磷酸化程度，最终引起细胞生命期的延长;而PRP19表达下调，其抵御凋亡的能力明显降低。
　　方法:分别采用免疫组化、westernblotting(anti-PRP19抗体)和real-timePCR的方法，检测PRP19在肺癌组织和癌旁组织中的表达情况及亚细胞定位。以肺腺癌细胞系A549作为体外模型进行转染。转染后，对细胞的增殖、侵袭、迁移、毒性耐受力和凋亡能力进行检测。对照组分别为转染空载体和未转染的A549细胞。
　　结果与讨论:PRP19广泛分布于肺腺癌组织中，并且其在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。组织芯片结果表明，172例肺癌组织中（66例原发型肺癌，53例转移型肺癌和53例正常组织）PRP19在癌组织中阳性率为78％，癌旁组织阳性率43％，p＜0.001。肺癌组织中,PRP19在mRNA水平的表达量是癌旁组织的20倍(p＜0.001)。过表达PRP19的肺腺癌细胞中，参与基因组损伤修复的p53表达下调而抑制细胞生长的p21表达上调。Transwell迁移实验、CCK-8增殖和克隆形成实验显示，PRP19过表达后细胞的迁移能力、增殖能力均显著低于对照组。小鼠成瘤性实验同样表明，实验组小鼠(A549-pEX-PRP19)经注射后肿瘤形成时间较长，大约为25±1天;而对照组的致瘤时间为18±1.4天(p=0.021)。注射6周后，实验组小鼠肿瘤大小为164±79mm3，对照组小鼠肿瘤大小为562±173mm3。PRP19过表(达)会显著抑制细胞凋亡。DAPI染色结果表明，顾铂处理24h后处于凋亡的第一阶段和第二阶段的对照组细胞明显多于实验组;48h时，对照组有76.6±2.8％的细胞处于凋亡的第二阶段和第三阶段，而实验组有59.3±2.1％的细胞处于凋亡的第一阶段和第二阶段，第三阶段的细胞数量最少。TUNEL实验结果与此相似，相同时间内实验组TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）明显少于对照组。经顺铂处理48h后，同一视野下对照组阳性细胞数量均值为84±11，实验组为45±8(p＜0.001)。随后，我们用westernblotting检测了凋亡相关蛋白的表达情况。其中，两组中Bax表达无明显差异;实验组中Bcl-2的表达显著增加而Caspase3的表达则明显减弱。这说明，PRP19过表达抑制凋亡可能是通过提高Bcl-2的表达使其发挥抗凋亡作用;同时又可以降低凋亡执行者Caspase3的表达，进一步对凋亡进行抑制。
　　结论:PRP19在人肺癌组织中表(达)显著高于癌旁组织。肺腺癌中PRP19过表达可以降低肿瘤形成能力。其作用机制可能是通过p21介导的细胞周期阻滞、延长DNA损伤修复时间使凋亡得到抑制，从而使细胞(增)(殖)和肿瘤生长得到抑制来实现的。