XAV939对肝星状细胞中Wnt/β-catenin与Wnt/JNK通路的影响及肝复康的干预机制

摘要

目的:
　　 作为肝纤维化发生过程中的核心环节，活化的肝星状细胞自身细胞外基质的分泌，引发肝纤维化。Wnt信号通路分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，在人和动物的生长过程中控制着无数的生物学现象。关于Wnt/β-catenin与Wnt/JNK信号通路参与肝星状细胞的活化的研究较多，但是研究结果存在着较大的分歧，对于Wnt/β-catenin与Wnt/JNK信号通路在肝星状细胞活化过程中所起的作用尚不能明确。中药肝复康经本实验室多次试验证实对Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信号通路具有较好的抑制作用，而XAV939为Wnt/β-catenin信号通路的特异性阻滞剂。本实验通过使用肝复康和XAV939作用于肝星状细胞HSC-T6株，来观察抑制Wnt/β-catenin和Wnt/JNK信号通路在肝星状细胞活化中所起的作用。希望本研究探讨肝星状细胞活化的分子机制并对肝纤维化的治疗有所帮助。
　　 方法:
　　 大鼠HSC-T6细胞株用含10％胎牛血清的DMEM培养基37℃，5％CO2混合气体的孵箱中培养，传代。待细胞条件合适时，细胞用不含血清的DMEM培养基饥饿培养24h。
　　 细胞于96细胞培养板孔板随机分为:正常血清组（含10％正常大鼠血清的DMEM培养基）;XAV9391umol/L组（含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培养基）;XAV9392umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培养基);XAV9394umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9394umol/L的DMEM培养基);XAV9398umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9398umol/L的DMEM培养基）肝复康治疗组（含10％肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基）。于37℃，5％CO2混合气体的孵箱中培养48h。采用MTT法观察肝星状细胞在不同浓度XAV939及肝复康药物血清的作用下细胞的生长增殖情况。
　　 细胞于六孔板中随机分为:正常血清组（含10％正常大鼠血清的DMEM培养基）;XAV9391umol/L组（含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培养基）;XAV9392umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培养基);肝复康治疗组（含10％肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基）。于37℃，5％CO2混合气体的孵箱中培养48h。逆转录-聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)法测定细胞中collagenⅠ，a-SMA，β-catenin，Wnt1，Frizzled1，Frizzled2，MKK4，MKK7，JNK等基因mRNA的表达，免疫蛋白印迹法(westernblot)观测细胞中β-catenin和p-JNK蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1.MTT法结果:与正常血清组相比，XAV9391umol/L，2umol/L，4umol/L，8umol/L组，以及肝复康血清组均对肝星状细胞的增值活化起到抑制作用，使用紫外分光光度计测量其OD值，发现与正常组相比，其他五组的抑制作用较明显(P＜0.05)。但是XAV9394umol/L，8umol/L组与XAV9392umol/L组差别无显著性。
　　 2.RT-PCR法结果:与正常血清组相比，肝复康血清组collagenⅠ，a-SMA,β-catenin,Wnt1,Frizzled1,Frizzled2,MKK4,MKK7,JNK1在基因水平表达均有明显的下降(P＜0.05)，XAV9391umol/L，2umol/L组collagen，a-SMA，β-catenin，Wnt1，Frizzled1在基因水平均有明显下降(P＜0.05)，其下降程度与肝复康药物血清组无显著性差别。XAV9391umol/L，2umol/L组Frizzled2，MKK4，MKK7，JNK1的表达与正常血清组比较无明显差别，但与肝复康药物血清组比较差别显著。
　　 3.Western-blot法结果:与正常血清组相比肝复康血清组β-catenin和p-JNK表达显著下降(P＜0.05)，XAV9391umol/L，2umol/L组β-catenin表达也显著下降(P＜0.05)，与肝复康组相比无显著性差别，而p-JNK表达则不明显。
　　 结论:
　　 1.在HSC-T6细胞活化过程中，Wnt/β-catenin信号通路相对于Wnt/JNK信号通路起主要作用。
　　 2.肝复康对Wnt/β-catenin和Wnt/JNK信号通路均存在着抑制作用，可能是通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制HSC-T6细胞活化。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．材料

1．1 中药

1．2 动物

1．3 细胞

1．4 主要试剂

1．5 主要仪器

2．方法

2．1 药物血清的制备

2．2 肝星状细胞的培养

2．3 MTT法检测细胞生长情况

2．4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中基因表达水平

2．5 Western印迹杂交(Western-blot)

2．6 统计学分析

结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢