ICC在慢性结石性胆囊炎豚鼠胆囊中的变化及菌陈蒿汤的干预作用

摘要

背景:胆囊是胆道动力的启动器官。其每天通过吸收肝胆汁中的水分和电解质，将胆汁浓缩同时储存起来，待消化需要时，借由胆囊收缩，将内部胆汁排入小肠，促进脂肪的消化和吸收，这一过程同时起到调节胆道压力的作用[1、2]。胆囊还可以分泌保护胆道系统的粘液[3]，是机体胆道系统的重要组成部分。慢性结石性胆囊炎是非常多见的一种胆道疾病，目前发病率逐渐升高，且多以女性为主。胆囊结石成石的原因很多，是一个复杂、综合的过程，其中胆囊收缩功能减弱是其主要原因，而由于胆囊中形成的结石不断刺激胆囊而产生慢性炎症病变，又会减弱胆囊收缩功能。当前临床上对于该病的治疗方式主要有药物和手术两种[4]，手术治疗主要有开腹胆囊切除术、腹腔镜胆囊切除术以及保胆取石术。但是手术治疗对机体损伤较大，且有一定不确定性，故近年来通过中西医结合方式治疗该病取得了理想的疗效。
　　目前已有研究表明，胆囊收缩功能的下降在胆石形成中起至关重要作用，是引起胆囊排空障碍的初始和关键动力学因素[5]，但是该动力学改变的机制尚没有完全阐明。自2007年HinescuME等[6]在患者切除的无瘤胆囊上首先确定了ICC（interstitialcellsofcajal，Cajal间质细胞）的存在后，人们对其研究达到了新的顶点。目前对胃肠道ICC的研究已经非常深入，且已经证实ICC参与了胃肠道神经递质的调节过程[7]，是胃肠道平滑肌运动的起搏者和传递者。胆囊壁与胃肠壁结构非常相似，胆囊ICC和胃肠ICC的超微结构同样具有相似之处，那么胆囊ICC是否如胃肠ICC一样，在胆囊运动机制中起着调控作用呢？我们需要首先从ICC与胆囊运动变化的关系进行研究。
　　茵陈蒿汤见于东汉张仲景的《伤寒论》，主要有茵陈、栀子、大黄三味药物，临床上往往用于清热、利胆、退黄、除湿和其他症状的治疗[8，9]。该方可作为治疗慢性结石性胆囊炎的配方，有着十分显著的功效。但是茵陈蒿汤通过何种方式起到治疗慢性结石性胆囊炎的作用，是否是通过增强胆囊收缩功能，而这是否与胆囊ICC细胞有一定关系，需要我们通过一系列实验进行研究。
　　目的:
　　第一部分:通过临床病例分析，观察慢性结石性胆囊炎患者胆囊收缩功能，并观察应用茵陈蒿汤治疗前后胆囊收缩功能的变化。
　　第二部分:本次实验通过喂食高胆固醇致石饲料建立慢性结石性胆囊炎豚鼠模型，并对其内治疗组灌喂茵陈蒿汤。各组胆囊组织通过免疫组化、RT-PCR和Western-Blot方法，对ICC特异性表达基因c-Kit进行观察:
　　1.ICC在慢性结石性胆囊炎豚鼠胆囊中细胞形态、数量的变化及c-KitmRNA和蛋白表达的变化;
　　2.经茵陈蒿汤治疗后，各组胆囊ICC细胞形态、数量的变化及c-KitmRNA和蛋白表达的变化。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.选取大连医科大学附属第一医院和大连医科大学附属第二医院住院和门诊的慢性结石性胆囊炎患者，并按照我们的入选指标和排除指标，最终确定受试人员。同时选取无相关胆道系统疾病的志愿者作为对照组，一同进行研究。
　　2.统计对照组及受检患者治疗前后使用B超检测胆囊收缩功能的方法测出的空腹状态下的胆囊容积、进食脂肪餐后的胆囊容积以及胆囊收缩率，并将上述数据录入数据库中。
　　3.对对照组以及受检患者治疗前后胆囊收缩率进行统计学分析，观察患者与对照组人员上述指标的差异以及患者治疗前后上述指标的变化。
　　第二部分:
　　1.选择健康的试验用普通级豚鼠，不限雌雄，随机分为三个组别即正常组、模型组和药物治疗组。正常组饲以标准豚鼠饲料，模型组和治疗组给予配制好的高胆固醇致石饲料，喂养8周，之后治疗组使用茵陈蒿汤进行灌胃，正常组和模型组使用相同体积的生理盐水进行灌胃，并继续之前的饲养计划，一共施行4周。
　　2.取各组豚鼠胆囊组织，通过包埋、切片、染色等步骤，对其进行HE染色，并在光镜下观察各组胆囊的病理学改变，应用独立双盲原则请病理学老师评定胆囊炎症程度，验证胆囊模型的建立是否成功。
　　3.取各组豚鼠胆囊组织，通过包埋、切片、孵育、染色等免疫组化步骤后，在荧光倒置显微镜下观察ICC细胞形态和数量的变化，并进行拍照。用Image-ProPlus6.0软件进行测定，分析平均光密度值。
　　4.取各组豚鼠胆囊组织，分别按照RT-PCR及WB方法进行操作，并用凝胶成像系统进行拍照。并使用目的条带和内参GAPDH条带的灰度值相比所得结果来分析各组中c-KitmRNA的表达;使用目的通道条带和β-actin条带的灰度值比值来分析各组中c-Kit蛋白的表达。
　　结果:
　　第一部分:
　　1.所选慢性结石性胆囊炎患者治疗前胆囊收缩率较对照组胆囊收缩率显著下降(P＜0.05)，其胆囊收缩功能表现为不良状态。
　　2.经过4周茵陈蒿汤治疗后，受检慢性结石性胆囊炎患者胆囊收缩功能得到显著升高(P＜0.05)。
　　3.所选慢性结石性胆囊炎患者经4周茵陈蒿汤治疗后，其胆囊收缩率与对照组没有显著性差异(P＞0.05)。
　　第二部分:
　　1.免疫组化结果显示模型组与正常组相比，c-Kit阳性表达细胞个数明显减少，细胞染色颜色明显变浅;治疗组较模型组c-Kit阳性表达细胞则相应增加，且细胞染色颜色较其加深。对免疫组化结果进行统计学分析，模型组c-Kit阳性表达情况较正常组显著下降(P＜0.05)，模型组c-Kit阳性表达较治疗组亦显著下降(P＜0.05)。
　　2.RT-PCR结果表示模型组c-KitmRNA的表达较正常组显著下降(P＜0.05)，较治疗组也显著下降(P＜0.05)。
　　3.对WB结果进行分析，显示c-Kit蛋白在模型组中的表达较正常组显著下降(P＜0.05)，且模型组c-Kit蛋白的表达较治疗组也是显著下降(P＜0.05)。
　　结论:慢性结石性胆囊炎患者胆囊收缩功能显著下降，经过茵陈蒿汤治疗后胆囊收缩功能明显升高;慢性结石性胆囊炎豚鼠中c-Kit的表达明显下降，治疗组中c-Kit的表达则较模型组显著升高。表明ICC的变化与慢性结石性胆囊炎胆囊动力减弱机制有着非常密切的关系，并且茵陈蒿汤通过增强胆囊收缩功能起到治疗慢性结石性胆囊炎的作用，该作用与ICC具有一定联系。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 茵陈蒿汤对慢性结石性胆囊炎患者胆囊收缩功能的影响

对象与方法

结果

讨论

结论

第二部分 豚鼠胆囊ICC与胆囊收缩功能关系的研究及茵陈蒿汤作用的探讨

材料与方法

结果

讨论

结论

全文结论

参考文献

综述 Cajal间质细胞在慢性结石性胆囊炎胆囊收缩功能减弱机制中作用的初步探讨

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢