孢子丝菌病快速诊断方法的探究

摘要

作为孢子丝菌病的病原菌，申克氏孢子丝菌主要致皮肤、皮下组织及附近淋巴组织的亚急性和（或）慢性感染，偶尔也可向内脏和骨骼播散，严重者甚至可引起全身的播散性感染。本病在我国东北地区相对多发，且部分区域可成批发生，对人们的健康构成严重威胁。尽管如此，该病的诊断较目前仍较为困难;真菌镜检及培养阳性率均较低，且培养耗时长（真菌生长缓慢）;组织病理也缺乏特异性，仅表现为肉芽肿性炎症，极易与其它感染性疾病想混。在该病的诊断方面，近些年来不少学者进行了多方面的探索（如血清学检测、电镜技术免、疫荧光抗体及免疫病理）。因存在特异性问题，血清学检测未能延续;免疫荧光抗体与免疫病理技术也因存在抗体不易标准化、病理易出现非特异染色等问题而使其应用受限;电镜技术由于存在视野小、操作复杂，寻找病原菌较为困难等问题而难以推广。本研究拟采用改进的CTAB法提取申克孢子丝菌基因组DNA，并根据申克孢子丝菌钙调蛋白基因保守序列设计合成一对寡核苷酸引物，通过PCR技术，以探讨快速检测及鉴定申克孢子丝菌的方法，进而建立一种能敏感、特异且快速地检测孢子丝菌病的分子生物学鉴定方法，以期为临床孢子丝菌病的诊疗工作提供可靠依据。
　　目的:1.探究申克孢子丝菌的DNA提取方法;
　　2.探索申克孢子丝茵的种特异性引物，运用聚合酶链反应方法鉴定申克孢子丝菌;从而为临床孢子丝菌病的诊疗工作提供分子生物学依据。
　　方法:1.用ViscozymeL酶替代液氮研磨破壁提取孢子丝菌的基因组DNA;
　　2.根据申克孢子丝茵钙调蛋白基因序列设计一对寡核苷酸引物，分别对52株申克孢子丝菌及3种6株普通真菌（曲霉、黑霉、白色念珠菌）的基因组DNA进行PCR扩增。
　　结果:1.用ViscozymeL酶替代液氮研磨破壁成功提取出孢子丝菌的基因组DNA。
　　2.特异性引物对52株申克孢子丝菌均可扩增出一条约430bp的片段，而对白色念珠茵、曲霉、黑霉基因组DNA扩增结果均为阴性。
　　结论:1.用ViscozymeL酶替代液氮研磨破壁提取孢子丝菌基因组DNA与传统的CTAB法相比不仅操作更简便，而且避免了液氮研磨过程中难于避免的污染。
　　2.运用我们所设计的特异性引物，结合PCR方法对申克孢子丝菌进行分子鉴定，结果显示不仅该引物对申克孢子丝菌特异、敏感而且该方法简便、快捷;有望为孢子丝菌病的分子生物学诊断奠定分子基础。

目录

声明

摘要

第一部分 申克孢子丝菌基因组DNA的提取及其特异性引物的设计

前言

(一)材料和方法

(二)实验结果

(三)讨论

第二部分 利用小鼠模型验证用于快速诊断孢子丝菌病的特异性引物

前言

(一)材料和方法

(三)结果

(四)讨论

参考文献

综述 孢子丝菌病的分子生物学诊断及其相关技术的研究进展

亚急性皮肤型红斑狼疮1例报道

致谢