锌-α2-糖蛋白与原发性肾小球疾病肾间质纤维化及白蛋白诱导NRK-52E细胞转分化程度的关系

摘要

目的:肾间质纤维化在原发性肾小球疾病的演变和转归中起重要作用。锌-α2-糖蛋白是一种多功能糖蛋白，在肾小管上皮细胞中有表达。本实验研究锌-α2-糖蛋白与原发性肾小球疾病肾间质纤维程度的关系，以寻求诊断原发性肾小球疾病肾间质纤维化新的生物标志物。
　　白蛋白刺激肾小管上皮细胞可促使其向成纤维细胞发生转分化(EMT)。锌-α2-糖蛋白在肾小管上皮细胞中有表达。本实验同时探讨锌-α2-糖蛋白与白蛋白诱导大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化程度的关系，为临床诊断原发性肾小球疾病肾间质纤维化提供理论和实验依据。
　　方法:选取我院临床诊断为原发性肾小球疾病行肾穿刺活检的患者共16例，清晨抽血并收集中断尿液，收集一般资料（性别、年龄、血肌酐、尿肌酐、胱抑素C、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、24小时尿蛋白），根据MDRD公式计算eGFR。收集的血、尿标本用ELISA法检测其锌α2糖蛋白含量。用Masson染色法对肾脏病理组织进行染色，在低倍显微镜下观察肾间质纤维化程度。分析血、尿ZAG与上述生化指标及肾间质纤维化程度的关系。同时收集20例健康人的血、尿，检测上述生化指标，分析其与原发性肾小球疾病患者上述指标间是否存在差异性。
　　体外用DMEM/F12培养基培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E），当细胞贴壁生长达60-70％融合时，给予不同浓度(0、0.5、1、5、10、30mg/ml)的去脂牛血清白蛋白(d-BSA)刺激NRK-52E细胞48小时;用同一浓度去脂牛血清白蛋白(d-BSA10mg/ml)刺激NRK-52E细胞不同时间（0、2、6、12、24、48小时）。收集总蛋白，通过Western blot法测定NRK-52E细胞ZAG及α-SMA蛋白表达水平。
　　结果:1.原发性肾小球疾病患者共16例（男/女10/6），健康对照组共20例（男/女12/8）。原发性肾小球疾病组与健康对照组比较，血液、尿液ZAG、胆固醇明显升高，有显著差异性(P＜0.01)。与健康对照组比较，性别、年龄、血尿素氮、血肌酐、甘油三酯均无差异性(P＞0.05);
　　2.16例原发性肾小球疾病患者血ZAG水平与尿ZAG、胱抑素C、血尿素氮、血肌酐、甘油三酯、胆固醇、eGFR无相关性(P＞0.05);尿ZAG水平与胱抑素C、血尿素氮、血肌酐、eGFR无相关性(P＞0.05)。
　　3.16例原发性肾小球疾病患者肾间质纤维化程度按照Banff病理分级结果:0级（0例）、1级（9例）、2级（7例）、3级（0例）。病理类型主要为:IgA肾病（7例）、轻度系膜增生性肾小球肾炎（5例）、（Ⅱ期）膜性肾病（2例）、增生硬化性肾小球肾炎（1例）、紫癜性肾炎（轻度系膜增生型）（1例）。
　　4.16例原发性肾小球疾病患者肾间质纤维化程度与尿ZAG、血胱抑素C呈正相关相(P＜0.05)。
　　5.不同浓度d-BSA刺激NRK-52E细胞48小时，随d-BSA浓度增加，ZAG及α-SAM蛋白水平表达增加。NRK-52E细胞ZAG的表达与d-BSA呈浓度依赖性。
　　6.同一浓度(10mg/ml)的d-BSA刺激NRK-52E细胞不同时间，在0、2、6、12小时均无ZAG及α-SMA的表达;在24、48小时ZAG及α-SMA有表达，且48小时ZAG及α-SMA的蛋白表达水平较24小时明显升高。NRK-52E细胞ZAG的表达与d-BSA呈时间依赖性。
　　7.在白蛋白诱导下NRK-52E细胞ZAG的表达量随α-SMA表达量的增加而增加。
　　结论:1.原发性肾小球疾病患者较健康对照组血、尿ZAG均有升高。
　　2.尿ZAG浓度可能成为原发性肾小球疾病肾间质纤维化的生物标志物。
　　3.在d-BSA刺激的NRK-52E细胞中，ZAG的表达水平与d-BSA呈浓度及时间依赖性，且ZAG的表达水平随α-SMA表达水平的升高而升高。
　　4.ZAG蛋白表达水平可能成为肾小管上皮细胞EMT程度的生物标志物。