骨髓内皮祖细胞移植对5/6肾切除大鼠肾间质纤维化和上皮细胞转分化的影响

摘要

目的:研究骨髓内皮祖细胞(EPCs)移植对5/6肾切除大鼠肾间质微血管密度、肾间质纤维化和上皮细胞转分化的影响.方法:(1)密度梯度离心法分离、培养骨髓单个核细胞,EGM-2特异性培基诱导培养,通过细胞形态观察、细胞免疫荧光细胞表面标志鉴定、摄取DIL-ac-LDL和结合FITC-UEA-Ⅰ能力试验鉴定内皮祖细胞. (2)6周龄SD雌鼠分两步行5/6肾切除手术,分模型组、假手术组和EPCs组,术后一周经尾静脉注射1ml生理盐水或EPCs悬液. (3)分别于注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w、8w、12w各处死2只GFP-EPCs组大鼠,取新鲜肾脏、肝脏、脾脏、心脏及血涂片,在荧光显微镜下观察各组织GFP的表达.(4)分别于注射后4周、8周、12周收集尿液和血液用于检测24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮和内生肌酐清除率,收集肾组织行肾脏间质纤维化评分,计算肾间质微血管密度,用免疫组化、Western blotting、Real-Time PCR方法检测TGF-β1、角蛋白、波形蛋白、α-SMA蛋白和基因水平.结果:(1)体外骨髓单个核细胞经EGM-2培基诱导培养先后呈现为圆形、鹅卵石形、梭形、多角形生长，符合内皮祖细胞形态，并同时表达CD133、vWF和VEGFR-2，能够同时摄取DIL-ac-LDL和结合FITC-UEA-Ⅰ。(2)表达GFP的EPCs逐渐定位于残肾中。(3)EPCs组在第8周和第12周血清尿素氮、肌配水平较模型组降低，肌配清除率较模型组升高;肾脏间质纤维化较模型组降低，管周毛细血管密度增高;EPCs组较模型组残肾组织中TGF-β，mRNA和蛋白水平均有降低，波形蛋白、a-SMAmRNA和蛋白表达水平均有下降，角蛋白mRNA和蛋白表达量增高。结论:(1)成功分离、培养实验骨髓单个核细胞，并诱导分化为骨髓内皮祖细胞。(2)骨髓EPCs通过尾静脉移植进入5/6肾切除模型大鼠后，可以逐渐定位于残肾组织中。(3)骨髓EPCs经尾静脉移植可改善5/6肾切除模型大鼠的肾功能，减轻肾间质纤维化，抑制肾间质毛细血管的减少和上皮转分化的发生程度。