转染TRA2B siRNA对肺腺癌A549细胞凋亡的影响并老年肺癌病例临床分析

摘要

目的:TRA2B是富含有丝氨酸/精氨酸的蛋白家族成员之一，它其中一个重要的功能是参与前体mRNA的选择性剪接，既往研究发现TRA2B在宫颈癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中高表达，目前已经有以TRA2B为靶点的肿瘤基因治疗，并且获得了初步的成果，但是国内外关于TRA2B基因在肺癌的研究依然很少。本实验通过运用RNA干扰技术，将siRNA-TRA2B成功转染至肺腺癌A549细胞后，观察A549细胞的细胞形态学变化和对A549细胞凋亡的影响，以及TRA2B在A549细胞上的表达情况，探索TRA2B在肺癌发生中的作用，为进一步将TRA2B作为靶点的肺癌基因靶向治疗提供理论性的依据。分析老年肺癌患者的病例，讨论影像学检查在肺癌的早期诊断及早期治疗的意义。
　　方法:设计针对肺腺癌TRA2B基因的siRNA-TRA2B，利用脂质体LipofectamineTM2000，将构建好的siRNA-TRA2B成功转染至肺腺癌A549细胞，运用显微镜观察细胞的形态学变化;运用Real-time PCR技术检测TRA2B mRNA的表达水平，并筛选出最有效的干扰RNA;运用Western blot技术检测TRA2B的蛋白表达水平，并筛选出最有效的干扰RNA;选择干扰效果最好的siRNA-TRA2B转染，运用流式细胞术检测转染siRNA-TRA2B后A549细胞的凋亡水平，运用Western blot技术检测转染siRNA-TRA2B后A549细胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达水平，探讨转染siRNA-TRA2B后，对Bcl-2、Bax表达的影响。通过选择3例老年肺癌患者的病例，将影像学检查与术后的病理结果进行对比分析，探讨影像学检查对肺癌的早期发现的重要临床价值。
　　结果:利用脂质体LipofectamineTM2000，将siRNA-TRA2B成功转染至肺腺癌A549细胞后:(1)显微镜下观察A549细胞发现:转染前，细胞状况良好，贴壁生长，多呈梭形，细胞质饱满，大小适中，核仁清晰，转染24、48h后细胞皱缩，贴壁不佳，转染效率达到90％以上。(2) Real-time PCR检测TRA2B mRNA的表达水平，并筛选出干扰效果最好的siRNA，结果显示:siRNA-TRA2B作用于A549细胞24h，48h后，TRA2B mRNA表达明显下调，而Mock组、Negative Control组及Black组的mRNA表达水平无明显变化，同时筛选出1-TRA2B-homo-544组干扰效果最好。(3) Western blot检测TRA2B蛋白的表达水平，并筛选出于扰效果最好的siRNA，结果显示:siRNA-TRA2B作用于A549细胞24h，48h后，TRA2B蛋白的表达明显下降，而Mock组、Negative Control组及Black组的蛋白表达水平无明显变化，同时筛选出1-TRA2B-homo-544组干扰效果最好。(4)流式细胞术检测干扰效果最好的siRNA-TRA2B组的细胞凋亡水平，结果显示:siRNA-TRA2B组凋亡率（48.02±0.495）％，Negative Control组凋亡率(8.60±0.251)％，Mock组凋亡率（8.47±0.156）％，Black组凋亡率（9.10±0.355）％，siRNA-TRA2B组与Mock组、Negative Control组及Black组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，Mock组、Negative Control组与Black组之间两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，转染siRNA-TRA2B后可促进细胞凋亡。(5)Western blot技术检测干扰效果最好的siRNA-TRA2B组的凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达水平，结果显示:siRNA组A549细胞中凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显下降，Bax的表达水平明显上升，而Mock组、Negative Control组及Black组的Bcl-2、Bax的表达水平无明显变化。3例老年肺癌患者的影像学结果与病理结果一致，因此，影像学检查可以作为肺癌的早期发现的重要手段。
　　结论:通过应用RNA干扰技术，可下调A549细胞中TRA2B的表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，TRA2B将有可能成为肺癌基因治疗的一个新靶点。影像学检查对老年病人肺癌的早期的发现及早期的诊治有着重要的意义。

目录

声明

摘要

第一部分 基础研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 临床病例分析

病例摘要

讨论

综述 SR蛋白及TRA2蛋白在恶性肿瘤研究中的进展

附录

致谢