依鲁替尼对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化和焦亡的调节作用及其与NLRP3炎症小体关系的研究

摘要

动脉粥样硬化早期,单核细胞在趋化因子的作用下被招募至病变处,与内皮细胞黏附,随后迁移至内皮下,转化为巨噬细胞。巨噬细胞摄入ox-LDL(oxidizedlow-density lipoprotein,氧化低密度脂蛋白)形成泡沫细胞,并大量死亡,形成动脉粥样硬化斑块的坏死核心,削弱纤维帽,增加斑块不稳定性。巨噬细胞的泡沫化和死亡是动脉粥样硬化发生、发展的关键环节。
　　近年来NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3,核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3)炎症小体在动脉粥样硬化中的作用越来越受到重视。研究显示NLRP3炎症小体参与动脉粥样硬化的形成,并与斑块的稳定性相关。NLRP3炎症小体可被ox-LDL激活,激活的炎症小体可剪切caspase-1前体(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1),促进成熟IL-1β(Interleukin-1β,白介素1β)的释放,诱导巨噬细胞焦亡,还可能参与细胞脂质沉积。
　　依鲁替尼是一种口服的BTK(Bruton's tyrosine kinase,布鲁顿酪氨酸激酶)抑制剂,临床上被用来治疗白血病。研究发现依鲁替尼可抑制明矾诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体激活,尚不知其对ox-LDL诱导的NLRP3炎症小体激活是否同样有抑制作用。据此提出假说:依鲁替尼可通过抑制NLRP3炎症小体的激活调节ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化和焦亡。
　　目的:观察依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞泡沫化和焦亡的影响,探讨其与NLRP3炎症小体的关系。
　　方法:以PMA诱导的THP-1或THP-1-defNLRP3起源巨噬细胞为研究对象。给予ox-LDL,构建细胞泡沫化、焦亡、迁移和黏附模型,并分别用依鲁替尼和MCC950(NLRP3特异性抑制剂)进行处理。采用Western Blot、ELISA方法检测巨噬细胞NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1、IL-1β水平,观察ox-LDL对巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的诱导作用,以及依鲁替尼对ox-LDL诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的影响。采用油红O染色、酶学法、免疫荧光、流式等方法观察依鲁替尼对巨噬细胞泡沫化、细胞内胆固醇含量、脂质摄入及胆固醇外流的影响,并采用Western Blot方法检测依鲁替尼对调节巨噬细胞胆固醇平衡的关键蛋白水平的影响,及其与NLRP3炎症小体的关系。分别用依鲁替尼、MCC950、VX765(caspase-1特异性抑制剂)等处理巨噬细胞,进行乳酸脱氢酶释放检测、Hoechst33342和碘化丙啶双染及TUNEL染色,验证ox-LDL对巨噬细胞焦亡的诱导作用,观察依鲁替尼对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡的影响,以及其与NLRP3炎症小体的关系。采用transwell小室、划痕实验及细胞黏附实验观察依鲁替尼对单核巨噬细胞迁移、黏附的影响及其与NLRP3炎症小体的关系。
　　结果:
　　(1)依鲁替尼可抑制ox-LDL诱导的THP-1起源的巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活。
　　(2)依鲁替尼、MCC950和NLRP3基因敲除均可以调节THP-1起源的巨噬细胞CD36、ABCA1和SR-BI蛋白表达水平,抑制细胞对ox-LDL的摄入,促进游离胆固醇外流,减轻细胞泡沫化程度。
　　(3)Ox-LDL可促进THP-1起源巨噬细胞乳酸脱氢酶的释放,增加PI染色细胞比率及TUNEL染色阳性率;依鲁替尼、MCC950、VX765和NLRP3基因敲除均可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞乳酸脱氢酶的释放,降低PI染色细胞比率及TUNEL染色阳性率。
　　(4)依鲁替尼和MCC950可不同程度的抑制THP-1细胞的迁移,但对THP-1细胞与内皮细胞的黏附无显著影响。
　　结论:依鲁替尼可能通过抑制NLRP3炎症小体的激活抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化和焦亡。

目录

声明

摘要

第一部分 依鲁替尼对ox-LDL诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的作用

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．PMA诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞

2．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源的巨噬细胞IL-1β释放的影响

3．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源的巨噬细胞IL-1β前体表达的影响

4．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞caspase-1激活的影响

5．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞NLRP3蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

第二部分 依鲁替尼对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．依鲁替尼、MCC950及NLRP3基因敲除对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞泡沫化的影响

2．依鲁替尼、MCC950及NLRP3基因敲除对THP-1起源巨噬细胞ox-LDL摄入的影响

3．依鲁替尼、MCC950及NLRP3基因敲除对THP-1起源巨噬细胞CD36和SR-A蛋白表达的影响

4．依鲁替尼、MCC950及NLRP3基因敲除对THP-1起源的巨噬细胞ACAT1和nCEH蛋白水平的影响

5．依鲁替尼、MCC950及NLRP3基因敲除对THP-1起源巨噬细胞胆固醇外流的影响

6．依鲁替尼、MCC950及NLRP3基因敲除对THP-1起源巨噬细胞ABCA1、ABCG1和SR-BI蛋白水平的影响

讨论

结论

参考文献

第三部分 依鲁替尼对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡的作用

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞LDH释放的作用

2．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞细胞膜破坏作用的影响

3．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1起源巨噬细胞DNA断裂的作用

4．依鲁替尼对THP-1单核细胞迁移的影响

5．依鲁替尼对THP-1巨噬细胞迁移的影响

6．依鲁替尼对ox-LDL诱导的THP-1细胞与HUVEC细胞黏附的影响

讨论

结论

参考文献

综述 NLRP3炎症小体的小分子抑制剂研究进展

致谢