中性粒细胞胞外陷阱在细菌性脓毒症中的作用及体外形成的研究

摘要

目的:
　　探究中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)在细菌性脓毒症患者外周血中的形成及其随着疾病进程的变化情况，并研究了普通型肺炎克雷伯杆菌(classic Klebsiella pneumoniae，cKP)与粘液型肺炎克雷伯杆菌(hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae，hvKP)在体内和体外形成NETs的差异。
　　方法:
　　收集2015年5月至11月大连医科大学附属第二医院收入的细菌性脓毒症患者60例。其中，致病菌为金黄色葡萄球菌的患者有10例，大肠埃希菌10例，铜绿假单胞菌10例，肺炎克雷伯杆菌30例，这当中包括普通型肺炎克雷伯杆菌15例，粘液型肺炎克雷伯杆菌15例。此外，选取30名健康体检者设置为健康对照。分别于患者入院的第一天和第七天收集细菌性脓毒症患者的外周血，密度梯度沉淀法分离纯化中性粒细胞。荧光染料Sytox Green明确NETs的存在。免疫荧光染色及核染色剂证明组蛋白H3与DNA共定位于NETs。Image-Pro Plus6.0微软系统对NETs进行定量检测，比较脓毒症患者与健康者外周血中NETs的形成情况及脓毒症患者经过抗生素治疗7天后NETs的变化情况。观察健康体检者的中性粒细胞分别与普通型和粘液型肺炎克雷伯杆菌孵育1小时后NETs的形成在数量和形态等方面有无不同，并计算细菌存活率。
　　结果:
　　1.60例细菌性脓毒症患者的外周血中检测到了NETs的存在，并且证明了组蛋白H3与DNA共定位于NETs;
　　2.脓毒症患者外周血中NETs的含量(42.358％±1.967)明显高于健康体检者(0.262％±0.041),(P＜0.05);
　　3.抗生素治疗7天后，处于感染消散期患者体内NETs的含量(19.793％±1.917)明显低于仍处在感染期的患者(51.191％±5.550)，(P＜0.05);
　　4.由粘液型肺炎克雷伯杆菌(hvKP)引起的细菌性脓毒症患者的外周血中NETs的含量(53.865％±1.385)明显高于由普通型肺炎克雷伯杆菌(cKP)引起的(27.628％±1.425),(P＜0.05);
　　5.两种不同表型的肺炎克雷伯杆菌分别与健康体检者中性粒细胞作用1小时后，粘液型肺炎克雷伯杆菌诱发健康体检者中性粒细胞释放的NETs的含量(44.581％±2.225)明显高于普通型肺炎克雷伯杆菌所释放的(28.022％±1.416)，(P＜0.05);
　　6.两种不同表型的肺炎克雷伯杆菌分别与健康体检者中性粒细胞作用1小时后，粘液型肺炎克雷伯杆菌的存活率(71.660％±1.446)明显高于普通型肺炎克雷伯杆菌(32.579％±1.155)，(P＜0.05)。
　　结论:
　　本次试验明确了细菌性脓毒症患者外周血中NETs的存在，且其含量明显高于健康对照组(P＜0.05)。DNA和组蛋白H3共定位于NETs。在脓毒症疾病进程中，NETs不仅具有强大的抗菌作用，还可能导致组织损伤和器官功能障碍。随着抗生素的使用，NETs的表达呈动态变化，消散期患者体内的NETs的含量明显低于感染期患者(P＜0.05)，并且NETs释放的峰值并不与感染时相的峰值同步。粘液型肺炎克雷伯杆菌与普通型肺炎克雷伯杆菌在体内、体外都可以诱发NETs的形成，但形成NETs的模式有差异。普通型肺炎克雷伯杆菌更易被中性粒细胞杀灭。粘液型肺炎克雷伯杆菌可能通过某些机制逃离NETs的捕获。NETs在细菌性脓毒症患者中起到重要作用，因此，开发针对NETs的靶向治疗有着广阔的发展前景。

目录

声明

摘要

(一)前言

(二)资料和方法

1．实验材料

1．1 一般资料

1．2 试验试剂与仪器

2．操作方法

2．1 中性粒细胞的分离与提纯

2．2 流式细胞仪测定中性粒细胞纯度

2．3 NETs的荧光染色

2．4 NETs的免疫荧光染色

2．5 细菌悬液的制备

2．6 cKP与hvKP体外形成NETs的检测

2．7 cKP与hvKP存活率的检测

2．8 试验中的注意事项

(三)统计分析

(四)实验结果

1．分离提纯的中性粒细胞

2．流式细胞术鉴定中性粒细胞纯度

3．外周血中NETs的形成

4．NETs的免疫荧光染色

5．NETs的动态变化

6．NETs形成的几个主要过程

7．cKP和hvKP引发的体内NETs的形成

8．cKP和hvKP引发的体外NETs的形成

9．细菌存活率的检测

(五)讨论

(六)结论

参考文献

综述 中性粒细胞胞外陷阱临床应用的研究进展

致谢