UBE2C与BRCA1在乳腺癌细胞株MDa-MB-231中表达及阿霉素耐药的作用机制

摘要

研究背景:泛素偶联酶2C(Ubiquitin-conjugating enzyme2C，UBE2C)是参与细胞周期进展、有丝分裂调控以及靶向降解短寿命的蛋白质。其具有癌基因性质的特质，在乳腺癌的发生发展中起到重要的作用。近几年有文献报道抑制UBE2C的合成可以潜在性提高乳腺癌细胞对于化疗药物的敏感性。提示UBE2C可能会成为乳腺癌治疗的潜在的靶点。
　　BRCA1作为乳腺癌易感基因，在多数散发性乳腺癌中可以检测到BRCA1表达缺失。BRCA1表达缺失的乳腺癌细胞多为侵袭性较强，具有三阴性乳腺癌的特征。并且BRCA1突变的乳腺癌细胞更容易获得对于阿霉素等药物的抵抗。近几年研究表明BRCA1与泛素-蛋白酶体系统中多个成员有相互作用的关系，并且可能参与影响肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。但是探讨UBE2C与BRCA1的相关报道甚少。因此，研究BRCA1的相关通路对于乳腺癌的发生发展及指导乳腺癌临床治疗是很有必要的。
　　研究目的:探讨UBE2C在乳腺癌各亚型中的分布及其与肿瘤分级、总生存率及无远处转移的生存关系。进一步探讨在乳腺癌细胞中UBE2C与BRCA1的相互作用关系及阿霉素耐药作用中可能存在的分子机制，为乳腺癌的治疗提供新的思路和实验依据。
　　方法:(1)在癌症基因数据库Cancer Genome Atlas/TCGA及Breast Cancer ResTreat2013数据库中检索UBE2C基因，分析UBE2C在乳腺癌类型中的分布及其与肿瘤分级、总生存率及无远处转移的生存关系。(2)利用siRNA瞬时转染技术，将设计的UBE2C-siRNA1、2、3以及BRCA1-siRNA4、5、6转染至三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，同时Negative control转染至MDA-MB-231细胞中作为阴性对照。采用实时定量PCR技术分别检测UBE2C mRNA及BRCA1 mRNA的表达水平。筛选出抑制效果最佳的siRNA用于后续实验。(3)瞬时转染UBE2C-siRNA2及BRCA1-siRNA5，Negative control到MCF-7及MDA-MB-231细胞，以未处理的MCF-7及MDA-MB-231细胞作为空白对照，采用western blot检测六组细胞中UBE2C、BRCA1的蛋白表达情况。(4)CCK-8检测干扰BRCA1后0、0.25、0.5、1、2、5(μg/ml)各浓度的阿霉素对MDA-MB-231细胞体外增殖能力的影响。同时瞬时转染BRCA1-siRNA5至MDA-MB-231细胞，未处理组的MDA-MB-231细胞作为阴性对照，将两组细胞分别培养于含有不同浓度阿霉素的培养基中，处理48h后检测UBE2C的蛋白表达水平。(5)将UBE2C-siRNA2转染至阿霉素处理48小时的MDA-MB-231细胞中，同时Negative control转染至阿霉素处理48小时的MDA-MB-231细胞中作为阴性对照，Negative control转染至未处理的MDA-MB-231细胞作为空白对照。采用实时定量PCR技术分别检测MRP1、BCRP、P-gp mRNA的表达水平。
　　结果:
　　(1)在TCGA数据中，比较正常乳腺组(n=22)与乳腺癌组(n=522)中UBE2C基因的表达情况，UBE2C在乳腺肿瘤组样本中转录水平约为正常乳腺组的6倍(P＜0.0001)。在Breast Cancer Res Treat2013数据库中乳腺癌各分级(grade1:n=29;grade2:n=136;grade3:n=35)，UBE2C与分级程度呈正相关。其分级程度越高的分组中UBE2C的表达水平越高(P＜0.0001)。
　　(2)通过比较Breast Cancer Res Treat2013数据中在女性初步诊断淋巴结阴性的乳腺肿瘤中，UBE2C高表达与肿瘤早期转移呈密切相关性(P＜0.001、HR=0.282)。高表达的UBE2C与增加的致死率呈强相关性(P＜0.05，HR＞2)。相对于UBE2C低表达的对照组来说，高表达UBE2C的实验组其生存期明显低于对照组。
　　(3) TCGA数据分析，在正常乳腺组(n=22)与基底样型乳腺癌组(n=98)中，UBE2C在基底样型乳腺癌组中的转录水平是正常组样本的四倍(P＜0.0001);比较乳腺癌各亚型(Normal-like:n=30;Luminal A:n=232;Luminal B:n=129;HER2阳性:n=58;基底样型:n=98)中UBE2C在正常乳腺上皮组中表达水平最低的，然而在基底样型乳腺癌中表达水平是最高的(P＜0.01)。
　　(4)UBE2C-siRNA1、2、3均可以抑制UBE2C mRNA的表达。BRCA1-siRNA4、5、6均可以抑制BRCA1 mRNA的表达。其中2、5号片段干扰效果最好。
　　(5)western blot检测结果提示与空白及阴性对照组相比，瞬时转染BRCA1-siRNA后，UBE2C表达量增加。然而下调UBE2C后，BRCA1基因表达不明显变化。
　　(6)CCK-8法结果提示，同在阿霉素处理下，与阴性对照组和空白对照组相比，沉默BRCA1的MDA-MB-231细胞活力显著增强(P＜0.02)。western blot结果分析在一定浓度范围内(0-lug/ml)阿霉素促进UBE2C的表达。
　　(7)实时定量PCR提示与阴性对照组比，MRP1、BCRP、P-gp mRNA表达在实验组均受到不同程度抑制。
　　结论:
　　1.UBE2C在乳腺癌组中高表达，与肿瘤分级呈正相关。UBE2C在基底样型乳腺癌表达量高于乳腺癌其他亚型，其表达高低与乳腺癌患者总生存期及无远处转移生存期密切相关。提示UBE2C可能是三阴性乳腺癌筛选及乳腺肿瘤复发转移的潜在分子标志物。
　　2.沉默BRCA1基因可以促进乳腺癌细胞MCF-7以及MDA-MB-231的UBE2C基因表达上调。提示BRCA1可能通过某种信号通路亦或者某种基因间接或直接地调控UBE2C转录和翻译。
　　3.沉默BRCA1的MDA-MB-231细胞更容易对阿霉素产生耐药性。UBE2C与耐药蛋白MRP1、BCRP、P-gp基因协同作用，促使沉默BRCA1的乳腺癌细胞株MDA-MB-231增强对于阿霉素的耐药性。提示UBE2C可能成为三阴性乳腺癌耐药的治疗靶点。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一、材料

二、方法

实验结果

1．UBE2C在乳腺癌组中高表达，与肿瘤分级呈正相关

2．UBE2C可以作为预测乳腺癌的转移复发及生存率预后的指标

3．UBE2C在基底样型乳腺癌中高表达

4．瞬时转染siRNA检测UBE2C及BRCA1的表达

5．BRCA1可以抑制UBE2C的表达

6．沉默UBE2C可以下调MRP1、BCRP、P-gP基因

讨论

结论

参考文献

综述 泛素偶联酶2C在乳腺癌中的作用及其意义

攻读学位期间发表文章情况

致谢