小细胞肺癌患者与健康人肠道菌群的差异性研究

摘要

研究背景和目的：小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC）约占全部肺癌的14%，它具有高度侵袭性，且生长迅速、倍增时间短、容易出现远处转移、预后差。SCLC确诊时多为广泛期（Extensive disease，ED），其对放化疗均敏感，近期客观缓解率高，但90％以上患者治疗后会在短期内出现复发和转移。人体的肠道内存在着大量的共生微生物，这些共生微生物种类超过1000种[1-2]。许多研究表明，机体肠道的共生微生物能够直接介入宿主的各种代谢进程，发挥了独特且重要的作用，并产生多种益于机体健康的代谢产物[2]。在正常情况时，肠道菌群与机体及外界环境之间保持一种相对平衡状态，来维持机体的健康，若上述平衡状态被打破，就会出现肠道菌群失调，便引起疾病产生[3]。有研究表明肠道菌群失调与多种疾病的发生有关。国内外目前研究多集中在消化道肿瘤与肠道菌群的关系。本研究通过对比初次确诊为SCLC的患者与健康人肠道菌群之间的差异，意从微生态学角度分析SCLC的发病因素，为SCLC的诊断、预防和治疗提供新策略。
　　方法：
　　1、临床粪便标本的收集：筛选大连医科大学附属第二医院肿瘤科14例经病理初次确诊为小细胞肺癌患者，于第一周期化疗前收集新鲜粪便标本一次并标记为1-14号，筛选年龄、性别、吸烟指数、生活地域等因素相匹配的14例健康人，同时收集新鲜粪便标本一次并标记为15-28号，将所收集的标本尽快放置在-80℃冰箱。第一组为1-7号和15-21号标本，第二组为8-14号和22-28号标本。
　　2、肠道细菌DNA的提取：利用粪便DNA提取试剂盒提取小细胞肺癌患者及健康人肠道细菌DNA。
　　3、采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法（PCR-DGGE）分析肠道菌群的变化：对肠道细菌进行PCR，PCR扩增成功后行DGGE，分析DGGE指纹图谱，切取差异明显条带测序，判断菌属类别。
　　4、结果的分析：运用Quantity One软件及SPSS19.0软件分析所得结果。
　　结果：
　　1、肠道细菌DNA提取及PCR扩增情况：14例初次确诊SCLC患者第一周期化疗前和健康人粪便均提取出肠道细菌DNA，不同粪便标本DNA浓度不同。肠道细菌DNA行PCR扩增后均出现目的条带。
　　2、SCLC组和健康对照组肠道菌群分析：
　　（1）第一组肠道菌群分析：健康对照组的多样性指数及丰富度均高于SCLC组，但是差异不显著（P＞0.05）。采用非加权法（UPGAMA）进行相似性聚类分析，结果显示，SCLC组和健康对照组未见分成两簇，两组间差异不显著。
　　（2）第二组肠道菌群分析：健康对照组的多样性指数及丰富度均高于SCLC组，但是差异不显著（P＞0.05）。采用非加权法（UPGAMA）进行相似性聚类分析，结果显示，SCLC组和健康对照组未见分成两簇，两组间差异不显著。
　　（3）SCLC组（1-14号）与健康对照组（15-28号）的肠道菌群分析：健康对照组的多样性指数及丰富度均高于SCLC组，多样性指数有统计学差异（P＜0.05），丰富度差异不显著（P＞0.05）。
　　（4）切胶、测序结果分析：切取DGGE图谱上变化明显的条带，1、3、7、8条带在SCLC组中亮度比健康对照组高，2、4、5、6、9条带在健康对照组亮度比SCLC组高。结果显示，条带1、3与嗜木聚糖真杆菌（Eubacterium xylanophilum）的同源性分别是98%和97%；条带2、6与普氏菌（Prevotella copri）的同源性分别是91%和97%；条带4与布劳特氏菌（Blautia sp.）的同源性是93%；条带5与Dialister succinatiphilus的同源性是92%；条带7与挑剔真杆菌（Eubacterium eligens）的同源性是100%；条带8与梭菌属（Clostridium sp.）的同源性是99%；条带9与瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis）的同源性是100%。
　　3、SCLC组肠道菌群分析：将14例SCLC患者分别按照分期、年龄、吸烟指数分组并进行统计学处理，结果表明，局限期组的多样性指数及丰富度均低于广泛期组，差异不明显（P＞0.05）；年龄＞60岁组的多样性指数及丰富度均高于年龄≤60岁组，差异不明显（P＞0.05）；吸烟指数＞692.857组的多样性指数及丰富度均高于吸烟指数≤692.857组，差异不明显（P＞0.05）。
　　结论：
　　1. SCLC患者肠道菌群与健康人之间存在差异，多样性差异显著，但丰富度差异不明显。
　　2.嗜木聚糖真杆菌、挑剔真杆菌及梭菌属的增多与SCLC的发生可能存在正相关；普氏菌、瘤胃假丁酸弧菌的减少与SCLC的发生可能存在正相关。
　　3. SCLC患者肠道菌群的结构与其分期、年龄、吸烟指数无显著相关性。

目录

声明

前言

材料和方法

一、材料

1. 临床粪便标本的收集：

2．主要的实验试剂

1. 提取粪便标本DNA

2. 粪便标本DNA浓度的检测

3. 聚酶链式反应（PCR）扩增

4. PCR扩增后产物的检测

5. 变性梯度凝胶电泳（DGGE）

6. 切胶及测序

7. 统计结果的分析

结果

1、肠道细菌DNA提取情况

2、PCR扩增情况

3、SCLC组与健康对照组肠道菌群的对比

（1） 第一组中SCLC组和健康对照组肠道菌群的DGGE结果分析

（2） 第二组中SCLC组和健康对照组肠道菌群的DGGE结果分析

（3）所有SCLC患者与健康对照组肠道菌群的对比

（4）切胶测序结果

4、SCLC组肠道菌群的对比

讨论

结论

参考文献

综述:肠道菌群与免疫的相关性研究

致谢