Survivin和CyclinD1在胃癌细胞株SGC7901/ADR 多药耐药的相关性研究

摘要

研究背景：
　　胃癌作为人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国呈现低早期诊断率，高死亡率的特点。化疗则是中晚期胃癌和胃癌术后的主要治疗手段之一，但是肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）的产生严重影响化疗疗效。肿瘤的多药耐药是很多因素共同作用的结果，其作用机制复杂，至今尚未明确。深入研究胃癌的多药耐药产生机制，实现耐药性的逆转，将会给胃癌的临床治疗带来新的突破。
　　生存素（survivin）和细胞周期蛋白D1（cyclinD1）在诸多肿瘤中都具有高表达特性，但在胃癌耐阿霉素细胞株SGC7901/ADR中未见明确研究。本课题组研究发现 Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin（β连环蛋白）在胃癌耐阿霉素药细胞株SGC7901/ADR中表达明显高于SGC7901细胞株，β-catenin可能参与胃癌MDR的过程。在S100A6基因下调的SGC7901质粒稳转细胞株中发现β-catenin也呈现低表达，β-catenin和 S100A6两者存在正相关性，均与耐药有关。Survivin和cyclinD1均作为Wnt/β-catenin下游具有争议的因子，在肿瘤多药耐药中的作用尚不明确，在胃癌及其耐阿霉素细胞中尚未有报导。
　　本研究采用Western Blotting（蛋白免疫印迹）、ICC（免疫细胞化学）、RT-PCR和CCK8（细胞增殖与活性检测）实验技术来检测survivin和cyclinD1在人胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞SGC7901/ADR和本课题组之前所构建的S100A6下调SCG7901细胞所导致β-catenin呈低表达的shRNA-1、shRNA-3质粒稳转细胞株的表达情况，探讨Wnt/β-catenin、survivin和cyclinD1三者之间是否存在关系，与胃癌耐药之间所存在的关系。为 Wnt/β-catenin通路作为临床治疗以及克服胃癌的多药耐药提供相关理论依据。
　　目的：
　　探讨survivin、cyclinD1与SGC7901/ADR细胞株中的多药耐药的关系，并进一步探讨survivin、cyclinD1与Wnt/β-catenin参与胃癌MDR的过程。
　　方法：
　　1、免疫细胞化学技术(ICC)、Western Blotting(WB)技术和RT-PCR技术检测survivin、cyclinD1在人胃癌SGC7901细胞及其耐阿霉素细胞SGC7901/ADR中的差异；2、ICC技术、WB技术和RT-PCR技术检测survivin、cyclinD1分别在SGC7901细胞中S100A6下调导致β-catenin低表达的shRNA-1、shRNA-3质粒稳转细胞中的表达差异。3、CCK-8细胞毒性实验检测上述五种细胞的半抑制浓度(IC50)和耐药指数（RI）。
　　结果：
　　1、Survivin结果显示：（1）ICC：survivin在SGC7901细胞浆深染成棕褐色，染色呈强阳性（+++）；SGC7901/ADR细胞浆和部分细胞核深染成棕褐色，染色呈强阳性（+++）；SGC7901、NC质粒稳转细胞为棕褐色，染色呈强阳性（+++），β-catenin低表达的shRNA-1、shRNA-3质粒稳转细胞胞浆染色呈棕黄色，染色呈阳性（++）。（2）Western blotting显示survivin蛋白在SGC7901/ADR细胞中平均表达量明显高于SGC7901细胞，差异性显著，p值＜0.05；SGC7901细胞中平均表达量明显高于β-catenin低表达的S100A6下调株shRNA-1和shRNA-3质粒稳转细胞，差异性显著，p值＜0.05。（3）RT-PCR结果显示：survivin在SGC7901/ADR细胞中的平均表达量高于SGC7901细胞，差异性显著，p值＜0.05。Survivin在 SGC7901细胞中平均表达量明显高于β-catenin低表达的S100A6下调株 shRNA-1和shRNA-3质粒稳转细胞的表达量，p值<0.05，有显著性差异。2、CyclinD1结果显示（1）ICC：cyclinD1在SGC7901部分细胞核深染成棕黄色，染色呈阳性（++），SGC7901/ADR细胞核深染成棕褐色，染色呈强阳性（+++）； SGC7901和NC质粒稳转细胞胞浆染色呈棕黄色，染色呈阳性（++）；β-catenin低表达的shRNA-1和 shRNA-3质粒稳转细胞胞浆无染色，染色呈阴性（—）。（2）Western blotting：cyclinD1显示SGC7901/ADR细胞中的平均表达量明显高于SGC7901细胞，差异性显著（p＜0.05）；SGC7901细胞中平均表达量明显高于β-catenin低表达的S100A6下调株 shRNA-1和 shRNA-3质粒稳转细胞的表达量，p<0.05，差异性显著。（3） RT-PCR结果显示：cyclinD1在SGC7901/ADR高于SGC7901细胞差异性显著（p＜0.05）；SGC7901细胞中 mRNA平均表达量明显高于S100A6下调至β-catenin低表达的shRNA-1和shRNA-3质粒稳转细胞的表达量，p值<0.05，具有显著差异。
　　结论：
　　1、Survivin和 cyclinD1参与人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR耐药，survivin、cyclinD1高表达，细胞的耐药性增加。
　　2、2、Survivin和 cyclinD1位于Wnt/β-catenin信号通路下游，参与胃癌的多药耐药。
　　3、3、β-catenin高表达，survivin和cyclinD1表达均增高；β-catenin低表达，survivin和cyclinD1表达均降低，β-catenin和survivin、β-catenin和cyclinD1表达存在一致性。

目录

声明

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、β-catenin与survivin、cyclinD1的胃癌MDR相关性研究分析：

二、survivin在SGC7901和SGC7901/ADR中的表达分析：

三、在β-catenin低表达细胞株中survivin表达情况

四、cyclinD1在SGC7901和SGC7901/ADR中的表达情况：

五、在β-catenin低表达细胞株中cyclinD1表达情况：

讨论

结论

参考文献

综述:Survivin的研究进展

致谢