PARP1协同PTEN在DNA损伤修复NHEJ通路中作用的研究

摘要

PARylation作为一种普遍存在的蛋白质转录后修饰的方式，调控了多种细胞生命活动进程。PARP1作为第一个被发现的PARP蛋白超家族成员，具有多种功能性结构域，参与了DNA损伤修复进程，作为治疗靶点已经用于卵巢癌、乳腺癌等癌症的治疗。由于对于PARP1参与 DNA损伤修复的具体分子机制还不是很清楚，并且PARP1对DNA双链断裂修复通路的相关调控机制还存在争议，因此，本文探讨了PARP1在DNA双链断裂修复通路NHEJ中的具体分子调控机制。我们的研究发现，PARP1抑制剂对于BRCA基因野生型的肿瘤细胞的杀伤是有限的，这与临床PARP抑制剂的使用策略相一致。为了使PARP抑制剂对于BRCA基因野生型的肿瘤细胞同样有效果，我们考虑可以通过降低同源重组修复效率来实现。Rad51蛋白作为参与同源重组修复的重要蛋白，它的抑制会有效降低同源重组修复效率。因此我们将PARP抑制剂与Rad51抑制剂联用，结果大幅度提高了肿瘤杀伤效果，这种联合用药策略可以作为一种潜在的临床肿瘤治疗方案。通过在293T细胞中过表达PARP1蛋白我们发现，PARP1能够提高总的NHEJ修复通路效率，分别表达不同的PARP1结构域，结果表明总的NHEJ效率的提升主要是通过提高A-NHEJ修复通路效率实现的，缺失了部分功能性结构域导致了NHEJ效率部分的降低，因此这种修复效率的提升是PARP1蛋白结构所依赖的。同时，对于PARP1不同结构域的研究显示，Cleaved-PARP1包含了P24和P89两个部分，它们失去了完整的PARP1蛋白在细胞核内富集的特性，说明了PARP1的断裂破坏了蛋白的核定位信号，使蛋白进入细胞核的效率降低。接下来我们具体研究了PARP1蛋白对于C-NEEJ通路重要蛋白Ku70的影响，我们发现PARP1能够和 Ku70蛋白结合，而且这种结合是物理性结合不依赖于DNA的偶联。同时，PARP1能够使Ku70蛋白PARylation，PARP1的这种调控依赖于它的酶活性，而且 PARP1的激活受到 PTEN这种抑癌基因的调控。在PTEN基因缺失的情况下，PARP1蛋白的自身PARylation被限制，不能有效的被激活而使Ku70蛋白PARylation，因此Ku70的PARylation水平和PTEN野生型情况下相比有明显降低。在细胞遭受辐照损伤后，PTEN野生型细胞中PARP1蛋白水平检测显示了其时间依赖性的先降低后升高并恢复到一般水平，而在PTEN缺失的细胞中没有检测到 PARP1蛋白的这种变化，而是趋于平稳。当在PTEN野生型细胞中加入PARP抑制剂处理时，没有检测到PARP1蛋白的变化，而是像 PTEN缺失的细胞 PARP1水平相对稳定不变。该结果进一步说明了PARP1蛋白水平的改变是通过其自身酶活性而使PARP1蛋白自身PARylation修饰实现的。mRNA水平检测显示了，PARP1基因的转录无论是在PTEN野生型细胞还是缺失的细胞中，均没有显著性差异，说明PARP1蛋白自身PARylation激活后，导致了其蛋白的不稳定，致使PARP1蛋白的降解，在细胞内含量降低。
　　综上所述，我们的研究发现了PARP1蛋白参与了NHEJ修复通路的调控，能够促进A-NHEJ修复通路效率，同时我们还发现PARP1这种修饰作用是受PTEN蛋白所调控的。我们的实验结果进一步阐明了PAPR1在NHEJ修复通路中的双重调控机制，部分的解释了目前对于PARP1蛋白参与 DNA修复存在的争议，为临床更好的针对于不同基因型肿瘤细胞使用PARP抑制剂提供了参考依据。

目录

声明

（一）前言

（二）材料和方法

1．材料

2. 方法

（三）结果

1. DNA损伤药物的联用增强了药物的抗肿瘤功效

2. PARP1上调A-NHEJ通路

4. PTEN促进了PARP1介导的Ku70蛋白的PARylation修饰

5. 活化后的PARP1蛋白变得不稳定而被降解

（四）讨论

1. DNA损伤药物和DNA损伤修复蛋白抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用

2. PARP1增强了NHEJ通路依赖的DNA损伤修复

3. PARP1蛋白的入核机制

4. PARP1蛋白介导的Ku70的PARylation修饰

5. PTEN对于PARP1蛋白的调控

（五）结论

参考文献

综述:多聚ADP核糖基化的机制及在抗肿瘤治疗中的应用

攻读学位期间发表文章情况

致谢