不同冻存条件对人颗粒脂肪活性影响的实验研究

摘要

目的：
　　探索不同冻存条件对人颗粒脂肪活力的影响，寻求更为满意的颗粒脂肪冻存条件，为临床自体脂肪移植提供理论依据。
　　方法：
　　常规方法收集41例自体脂肪移植求美者大腿内侧颗粒脂肪标本，经生理盐水漂洗2次静置分离后加入相应留存脂肪量等体积的含60%小牛血清+25%DMEM高糖培养基（Dulbecco Modified Eagle Medium，伯克改良伊格尔培养基）+15%DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）低温冻存保护液冻存。将所获脂肪标本一式三份，按照-20℃（普通冰箱）、-80℃（深低温冰箱）和-196℃（液氮）3种不同条件下冻存。选择冻存3个月和6个月的标本复温，通过苏木精-伊红(HE)染色观察脂肪细胞形态、台盼蓝染色法分析脂肪细胞存活率、肌酸激酶测定酶活力、免疫组化CD105检测脂肪干细胞数量，比较三种冻存温度下冻存3个月及6个月后脂肪细胞活力变化情况。应用经三种温度冻存6个月后的颗粒脂肪组织进行裸鼠体内移植建模，于6只裸鼠背部皮下进行注射移植，4周后取出，测量体积、HE染色及透射电镜观察并比较移植后脂肪组织的成活及血管化情况。所有数据均采用SPSS17.0统计包进行数据处理及分析。
　　结果：
　　1.体外检测脂肪细胞活力：
　　（1）台盼蓝染色法脂肪细胞计数分析脂肪细胞存活率，-20℃、-80℃、-196℃三种温度下冻存3个月后的脂肪细胞存活率分别是18.79±2.51%、86.21±1.51%、90.05±2.77%；冻存6个月后分别是8.67±1.83%、81.34±2.39%、89.31±2.65%，三组组间比较Ρ值均<0.05，差异有统计学意义。在同一冻存时间下，-20℃、-80℃及-196℃各组的脂肪细胞存活率逐渐升高，-196℃温度冻存后存活的脂肪细胞数量最多，-20℃温度下冻存后存活脂肪细胞数量最少（Ρ<0.05）。在同一冻存温度下，-20℃及-80℃冻存3个月组的脂肪细胞存活率明显高于6个月组，-196℃下两组冻存时间无显著性差异（Ρ>0.05）。
　　（2）肌酸激酶测定，-20℃、-80℃、-196℃三种温度下冻存3个月后的OD值是0.042±0.003、0.072±0.002、0.081±0.002；冻存6个月后分别是0.038±0.002、0.063±0.002、0.079±0.003，三组组间比较Ρ值均<0.05，差异有统计学意义。相同温度下，-20℃和-80℃冻存3个月的酶活力高于冻存6个月（Ρ<0.05），-196℃冻存温度下，3个月及6个月无差异（Ρ>0.05）；相同冻存时间下，-196℃组酶活力最高，-80℃组次之，-20℃组最低（Ρ<0.05）。
　　（3）各组HE染色显微镜下比较脂肪细胞形态发现，-20℃条件下冻存3个月组细胞膜破裂严重，网状连接部分中断，偶可见细胞核存在；而6个月组细胞膜破裂更加严重，网状连接中断，细胞核几乎消失，且存在较多坏死区及囊腔和空泡；-80℃组两段时间较-20℃组明显改善；-196℃条件下冻存3个月及6个月两组间脂肪细胞形态基本保持正常，冻存后基本未受损伤。各组经免疫组化CD105染色后，-20℃组未见ADSCs，在-80℃组及-196℃组仅见少数ADSCs。
　　2.颗粒脂肪裸鼠移植建模：注射移植冻存颗粒脂肪于裸鼠背部皮下，4周后取出，经-20℃、-80℃及-196℃三种温度冻存6个月的颗粒脂肪移植后体积减少率分别为90%、65%、55%。HE染色形态学观察发现，-20℃组脂肪细胞形态尚可，网状纤维欠发达，仍可见细胞膜破裂情况，其余两组存活状况良好，可见完整脂肪小叶结构，细胞形态逐渐趋于稳定，部分血管长入。透射电镜观察冻存脂肪移植4周后细胞超微结构，-20℃组含较多新生脂肪细胞，-80℃及-196℃组脂肪细胞更加成熟，-196℃组已可见成熟脂肪细胞轮廓，并且在脂肪细胞周围长入的新生毛细血管数量最多。
　　结论：
　　1、使用经冻存的颗粒脂肪组织进行移植具可行性。
　　2、-196℃冻存组脂肪细胞活性优于-80℃及-20℃冻存组。
　　3、-196℃下可冻存6个月，甚至更长时间，是较理想的冻存温度。-80℃冻存6个月后脂肪细胞活力不及冻存3个月时，可用于短期保存。不建议选择-20℃进行冻存。

目录

声明

前言

材料与方法

第一部分 脂肪标本的采集

一、 临床资料

二、试剂、仪器及耗材

三、方法

四、结果

第二部分 脂肪细胞活性的体内、外实验研究

一、体外检测脂肪细胞活力

二、颗粒脂肪裸鼠移植建模

三、数据统计

结果

一、体外检测脂肪细胞活力

（一）台盼蓝染色法脂肪细胞计数分析脂肪细胞存活率

（二）肌酸激酶测定

（三）HE染色

（四）免疫组织化学染色

二、颗粒脂肪裸鼠移植建模

讨论

一、颗粒脂肪的获取部位和方法

二、不同冻存温度及冻存时间的体外实验比较

三、体内实验—冻存颗粒脂肪裸鼠移植建模

结论

参考文献

综述:不同获取、纯化方法影响脂肪细胞活性研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢