下调DNA修复基因GADD45A增强黑色素瘤化疗敏感性的机制研究

摘要

背景：黑色素瘤是一种皮肤恶性肿瘤，其早期不易发现，晚期极易转移，并且具有极高的化疗耐药性。目前，癌症治疗最有效的手段是手术、放疗、化疗和免疫治疗。化疗是一种全身治疗的手段，通过静脉给药途径，化学药物会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此，高转移性的恶性黑色素瘤的主要治疗手段是化疗。顺铂是一种治疗癌症常用的铂类化疗药物，能够造成细胞DNA损伤，诱导细胞凋亡，抑制细胞生长增殖，从而杀伤癌细胞。但是肿瘤细胞通过抑制药物的摄取以及增强DNA损伤修复功能，产生化疗耐药。针对化疗耐药的DNA损伤修复机制尚不明确，发现新型有效的作用靶点对增强肿瘤细胞化疗敏感性具有重要意义。GADD45A（Growth Arrest and DNA damage-inducible45 A）是DNA损伤修复的关键基因，在细胞凋亡和细胞周期调控中发挥重要的作用。通常在损伤因子作用后，GADD45A随着DNA损伤修复通路的诱导而产生。因此，GADD45A基因在肿瘤细胞耐药中起着重要的作用。
　　目的：该研究主要通过下调DNA损伤修复基因GADD45A的表达，研究其在黑色素瘤化疗耐药中的作用机制，能够作为新的作用靶点增强黑色素瘤化疗敏感性，从而达到治愈的效果。
　　方法：1.利用qPCR array检测在顺铂作用下的黑色素瘤A375细胞中的84种DNA损伤修复基因的mRNA表达情况。2.根据目的基因GADD45A的碱基序列，设计特异的siRNA及无关（negative control）干扰序列。利用小RNA干扰技术，通过lipofectamin2000脂质体法瞬时转染A375细胞，获得GADD45A表达下调的细胞模型。3.qPCR和Western Blot方法检测细胞中目的基因的mRNA及蛋白质水平的表达情况。4.采用MTT法和克隆形成实验检测体外培养的A375细胞的生长和增殖情况。5.细胞流式法检测细胞的周期和凋亡变化情况。6.利用彗星实验和细胞免疫荧光检测A375细胞在顺铂作用下，细胞DNA损伤和DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达情况。
　　结果：1. PCR array结果表明，顺铂作用于A375细胞后，84种DNA损伤修复基因中有12种基因表达水平升高两倍以上，其中GADD45A基因mRNA表达水平升高5倍以上。2. qPCR和Western Blot结果验证了GADD45A基因的表达水平受顺铂的诱导作用明显升高，并且具有浓度和时间依赖性。3.利用小RNA干扰技术，成功获得GADD45A表达下调的细胞模型。4. MTT法和克隆形成实验结果表明，GADD45A表达下调组细胞受顺铂药物的生长和增殖抑制作用明显高于对照组细胞。5.细胞流式结果表明，GADD45A表达下调组细胞受顺铂药物的凋亡诱导作用明显高于对照组细胞，并且与细胞周期的调节有关。6.彗星实验和细胞免疫荧光结果表明，GADD45A表达下调组细胞受顺铂药物的DNA损伤诱导作用明显高于对照组细胞，说明GADD45A基因表达下调能够增强黑色素瘤细胞的化疗敏感性。7. Western Blot结果显示MEK抑制剂影响GADD45A的表达，说明MAPK信号通路参与调节GADD45A的表达。
　　结论：GADD45A基因表达下调能够明显增强黑色素瘤细胞的化疗敏感性，说明该基因在诱导黑色素瘤细胞产生化疗耐药性中起着至关重要的作用，并且GADD45A基因有望成为新的分子作用靶点，成为降低恶性黑色素瘤耐药性的有效作用靶点。

目录

声明

前言

材料和方法

1. 材料

1.1. 细胞系

1.2. 主要仪器及试剂

2. 方法

2.1. PCR array

2.2. 脂质体瞬时转染抑制GADD45A蛋白的表达

2.3. MTT 法检测A375细胞生长活力

2.4. 流式细胞术检测细胞周期变化情况

2.5. 流式细胞术检测细胞凋亡情况

2.5. Western Blot 检测相关蛋白表达水平的变化情况

2.6. 克隆形成实验检测细胞增殖变化

2.7. 彗星实验检测细胞DNA损伤情况

2.8. 细胞免疫荧光

1. 化疗药物上调DNA修复基因表达

2. 顺铂诱导黑色素瘤A375细胞中GADD45A基因的表达

3. GADD45A对细胞增殖与生长的影响

4. GADD45A通过DNA损伤修复增强黑色素瘤细胞的耐药性

5. GADD45A对细胞凋亡的影响细胞

6. GADD45A参与调控细胞周期

7. MAPK信号通路参与调控 GADD45A蛋白表达

讨论

结论

参考文献

综述:GADD45A与肿瘤治疗相关研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢