大黄素对重症急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞损伤干预机制的研究

摘要

背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是较常见的急腹症之一，有约20％的病例可能发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，早期即可发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)乃至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。尽管各种相关诊疗观念和技术不断改进，但SAP仍以20-30％的死亡率高居急腹症之首。在中国，急性胆道疾病为SAP的常见病因。中医理论认为，“腑气不通”在SAP发病机制中具有重要作用，依据中医“六腑以通为用”的医理，在疾病初期采用通里攻下之法，清泄湿热，使邪外出，是控制该病转归之关键。中药大黄兼顾通下与化瘀，是治疗SAP的第一要药。大黄素(1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，Emodin)是一种由大黄Rheum palmatum L.)提取纯化而来的蒽醌类化合物，也是药物合成的重要先导物，其药理作用与大黄有许多相似之处。Emodin具有抗炎、通便、改善微循环和免疫调节等多种药理作用，具有较好的临床应用价值。动物实验发现应用Emodm治疗SAP疗效显著，不足之处在于药物作用靶点及分子机制不明确，这也阻碍了Emodin在临床治疗中的进一步推广应用。因此，深入探究Emodin防治SAP的药理作用及分子机制，可以为临床上治疗SAP的新药研发提供理论依据。
　　目的:基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)蛋白质组学技术寻找并确定Emodin治疗SAP早期大鼠胰腺组织内特征性异常表达的蛋白标志物，多层次探究Emodin治疗SAP过程中的药物作用靶点与干预途径。
　　方法:(1)在基于iTRAQ蛋白质组学筛选Emodin治疗SAP大鼠的组织特异性标志物及干预机制的研究中，采用胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠(sodium taurocholate，STC)的方法诱导SD(Sprague Dawley)大鼠SAP模型。实验动物随机分成5组:假手术(sham operation，SO)组、SAP模型组和高、中、低剂量给药组(Emodin，60、30和15mg/kg)。实验动物于造模手术苏醒后即刻和第6h分别灌胃给予Emodin一次。术后12h麻醉处死，检测血浆淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)、白介素(interleukin，IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)水平，结合组织病理学和胰腺细胞超微结构改变等指标来评价Emodin对SAP大鼠的保护作用;免疫组织化学和免疫荧光化学染色观察胰腺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)表达水平，同时测定组织中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平来考察Emodin的抗炎活性;采用iTRAQ蛋白质组学技术分析SO、SAP和Emodin给药组间的差异表达蛋白，寻找并确定Emodm治疗SAP早期大鼠胰腺组织内的特征性异常表达的蛋白标志物，并进一步探讨Emodin治疗SAP的分子机制。
　　(2)在Emodin改善STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤的体外研究中，以大鼠胰腺腺泡AR42J细胞为研究对象，Emodin(40、20和10μM)预处理2h，STC诱导腺泡细胞损伤。采用MTT法检测细胞活力，同时检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的释放量来评价不同浓度的Emodin对STC诱导的细胞损伤的保护作用;测定淀粉酶、蛋白酶(trypsin)活力以及细胞培养基中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量来考察Emodin的体外抗炎活性;采用免疫荧光细胞化学及western blotting方法考察Emodin对AR42J细胞中HTRA1/TGF-β1信号通路相关蛋白表达水平的影响。根据大鼠HTRA1基因的mRNA序列，构建HTRA1基因过表达质粒，在Lipofectamine2000的介导下体外转染AR42J细胞用以验证Emodin是否通过抑制HTRA1/TGF-β1信号通路发挥对胰腺腺泡细胞的保护作用。
　　(3)在STC诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的细胞模型与动物实验中，研究microRNA(miRNA)对HTRA1/TGF-β1信号通路的调控及Emodin干预机制，采用生物信息学分析方法筛选参与调控HTRA1基因表达的上游miRNA。构建HTRA1基因的野生型和突变型，通过双荧光素酶报告基因实验验证候选上游miRNA对HTRA1基因表达是否具有调控作用。AR42J细胞经不同浓度Emodin(40、20和10μM)预处理2h后，STC诱导细胞损伤，采用Real-time PCR检测对照(Control)组、模型(Model)组和给药(Emodin)组中miRNA是否存在表达差异。然后体外转染miRNA inhibitor或体内转染miRNA antagomir，测定细胞培养液和大鼠血浆中的淀粉酶、脂肪酶及IL-6、IL-1β和TNF-α水平，采用Real-time PCR检测IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平;最后，采用western blotting方法观察HTRA1/TGF-β1信号通路相关蛋白的表达情况。
　　结果:(1)在基于iTRAQ蛋白质组学筛选Emodin治疗SAP大鼠的组织特异性标志物及干预机制的研究中:与SAP组相比，Emodin能显著降低大鼠血浆淀粉酶、脂肪酶、IL-6、IL-1β和TNF-α含量，减轻胰腺组织病理损伤和胰腺细胞超微结构改变。免疫组织化学和免疫荧光化学结果显示Emodjn下调胰腺组织中MPO表达;Real-time PCR结果表明Emodin对胰腺组织中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平具有明显的抑制作用。通过iTRAQ蛋白质组学分析技术从大鼠胰腺组织中筛选出32个差异表达蛋白，并从中发现了一种与SAP密切相关的新生物标志物——高温需求因子A1(high-temperature requirement A1，HTRA1)。进一步的分子机制研究表明Emodin能够影响HTRA1/TGF-β1信号通路相关蛋白表达，下调HTRA1、IL43、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88，MyD88)、TNF受体相关因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF-6)和核因子-kappa B(nuclear factor-κB，NF-κB)等蛋白表达水平，上调转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)蛋白的表达水平。
　　(2)在HTRA1/TGF-β1信号通路在STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤中的作用及Emodin干预机制的体外研究中:STC浓度为498.2μM时，可以诱导50％的AR42J细胞死亡。与Model组相比，Emodin（40、20、10、5和2.5μM）预处理2h以剂量依赖性的方式显著提高AR42J细胞的相对细胞活力。同时，Emodin能显著减少损伤细胞的淀粉酶、蛋白酶水平及IL-6、IL-1β和TNT-α的释放量，对STC诱导的AR42J细胞损伤具有保护作用。分子机制研究表明Emodin减轻STC诱导的腺泡细胞损伤是通过抑制HTRA1蛋白表达，上调TGF-β1蛋白表达水平，从而下调IL-33、MyD88、TRAF-6和NF-κB等蛋白表达水平来实现的;进一步的HTRA1基因过表达实验结果表明，过表达HTRA1基因则导致Emodin缓解胰腺腺泡细胞损伤的作用显著减弱，提示HTRA1可能是Emodin改善STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤的潜在药物作用靶点，干预途径可能是HTRA1/TGF-β1信号通路。
　　(3)在miRNA调控HTRA1/TGF-β1信号通路在STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤中的作用及Emodin干预机制的研究中:基于生物信息学方法，共筛选出了8个可能参与调控HTRA1基因表达的miRNA。进一步的RNA序列比对发现miR-30a-5p在HTRA1mRNA的3'-UTR区域有潜在的结合位点，推测HTRA1作为miR-30a-5p靶基因的可能性较大，该预测随后被双荧光素酶报告基因实验所证实。此外，western blotting分析结果表明miR-30a-5p可显著下调HTRA1蛋白表达水平，从而阻碍HTRA1对其下游分子TGF-β1的抑制作用。Real-time PCR结果显示，与Model组相比，Emodm（40、20和10μM）预处理能显著上调AR42J细胞中miR-30a-5p表达水平;转染miR-30a-5p inhibitor的细胞实验及转染miR-30a-5pantagomir的动物实验结果显示，抑制miR-30a-5p的表达，则Emodin对胰腺腺泡细胞损伤的保护作用明显减弱。
　　结论:(1)HTRA1作为SAP早期大鼠的胰腺组织内特征性生物标志物可能是Emodin治疗SAP的潜在药物作用靶点;(2)Emodin可能通过调节HTRA1/TGF-β1信号通路部分发挥其治疗SAP的药理作用;(3)Emodin可能通过上调miR-30a-5p表达来抑制HTRA1/TGF-β1信号通路活化，从而改善STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 基于iTRAQ蛋白质组学的Emodin对重症急性胰腺炎大鼠胰腺HTRA1／TGF-β1信号通路的影响

引言

材料和方法

1．材料

2．方法

结果

1．Emodin降低SAP大鼠血浆酶学指标和炎性因子水平

2．Emodin减轻SAP大鼠胰腺组织病理学和细胞超微结构损伤

3．Emodin抑制SAP大鼠胰腺组织MPO蛋白表达

4．Emodin抑制SAP大鼠胰腺组织炎性因子mRNA表达

5．iTRAQ蛋白质组学分析大鼠胰腺蛋白质差异表达

6．差异表达蛋白质的功能分类

7．Emodin对HTRA1／TGF-β1信号通路相关蛋白表达的影响

讨论

小结

参考文献

第二部分 HTRA1／TGF-β1信号通路在STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤中的作用及Emodin干预的体外研究

引言

材料和方法

1．材料

2．方法

2．Emodin对AR42J细胞活力的影响

3．Emodin改善STC诱导的AR42J细胞损伤

4．Emodin抑制AR42J细胞合成、分泌胰蛋白酶和淀粉酶

5．Emodin抑制AR42J细胞释放炎性因子

6．Emodin对STC损伤的AR42J细胞内HTRA1／TGF-β1信号通路的抑制作用

7．过表达HTRA1基因抵抗Emodin对STC损伤的AR42J细胞的保护作用

讨论

小结

参考文献

第三部分 miR-30a-5p调控HTRAl／TGF-β1信号通路在STC诱导的胰腺腺泡细胞损伤中的作用及Emodin干预机制

引言

材料和方法

1．材料

2．方法

结果

4．miR-30a-5p影响HTRA1对下游TGF-β1的抑制作用

5．miR-30a-5p inhibitor抵抗Emodin对STC诱导损伤的AR42J细胞的保护作用

6．miR-30a-5p antagomir抵抗Emodin对SAP大鼠的治疗作用

7．miR-30a-5p antagomir抵抗Emodin对炎症反应的抑制作用

8．Emodin上调miR-30a-5p抑制HTRA1／TGF-β1信号通路激活

讨论

小结

参考文献

结论

不足与展望

综述 中草药治疗急性胰腺炎：药理活性与作用机制

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢