乳腺癌肿瘤干细胞的基因组与转录组研究

摘要

背景:
　　肿瘤干细胞是一群具有自我更新能力的细胞，在肿瘤的发生、发展以及复发、耐药过程中发挥重要作用。关于肿瘤干细胞的来源及本质特征存在很大争议，目前有以下几种观点:第一，肿瘤细胞通过获得某些突变成为肿瘤干细胞，从而获得自我更新能力，也就是说肿瘤干细胞是一种可遗传的内在属性。第二，肿瘤干细胞没有明确的遗传学变异，而是体现在一种转录组水平的可变性，即肿瘤细胞的可塑性。基于此，本课题拟运用基因组与转录组测序分析和生物信息学方法，深入阐明肿瘤于细胞的特性，明确其与非肿瘤干细胞的本质差异。
　　乳腺癌发病率高，极易发生转移及复发，是研究肿瘤干细胞的良好疾病模型，明确乳腺癌肿瘤干细胞(Breast Cancer Stem Cells，BCSCs)的特性，可以为临床靶向BCSCs治疗开辟新思路。尽管针对BCSCs的相关研究已有报道，但是BCSCs的身份特性以及促使BCSCs形成的关键因素仍尚不清楚。鉴于此，本研究旨在揭示BCSCs自我更新能力是否由基因组水平突变决定，以及通过对比乳腺癌肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞之间的基因组与转录组差异探明其内在特点，从而为研发针对BCSCs的靶向药物提供方向，为肿瘤的精准治疗提供策略。
　　方法:
　　(1)研究对象为乳腺癌细胞系（MDA-MB-231），应用微球体连续传代悬浮培养的方法富集BCSCs，并用ALDH1流式分选方法进行鉴定。
　　(2)将收集的细胞样品进行全基因组测序(Whole Genome Sequencing，WGS)，对测序结果得到的突变位点以及相关的变异频率行滑动窗口(sliding window)分析，检测这些位点是否存在密集分布区域（hotspot区域，即最有可能包含BCSCs特异性突变位点的区域）。
　　(3)根据突变位点的分布特征，建立统计学模型，应用行程长度编码压缩(Run-length encoding，RLE)算法，检测hotspot区域。
　　(4)在群体细胞水平，对前面得到的hotspot区域行靶向深度测序，深入探究靶区内基因组水平突变信息是否为BCSCs特异性携带。
　　(5)进行单细胞体外成球实验，收集单细胞来源的微球体（即BCSCs），以及不能成球的单细胞（即非乳腺癌肿瘤干细胞，non-BCSCs，NBCSCs），在单细胞水平利用单细胞全基因组扩增技术，扩增基因组信息，针对WGS中获得的hotspot区域（命名为WHM靶区）以及数据库中获得的常见肿瘤热点突变区域（命名为CHM靶区），同时进行靶向深度测序。利用二项分布检验，建立统计学模型，逐一检测每个位点的基因组差异，并进行随机分组(permutation)，深入分析靶区内基因组水平突变信息是否为BCSCs特异性携带。
　　(6)分离1000个左右的单细胞培养于微球体悬浮培养环境（1个细胞/孔），收集乳腺癌肿瘤于细胞与非肿瘤干细胞，进行单细胞水平的转录组测序，将两组转录组数据进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)，以明确单细胞转录组水平差异是否与BCSCs表型相关。
　　(7)生物信息学方法筛选差异表达基因，明确BCSCs特异性高表达的(BCSCsHighly Expressed，BHE)基因，并在多次基于大量细胞的转录组测序中进行验证。
　　(8)针对BEE基因，进行功能(Gene Ontology，GO)分析及STRING网络富集分析，探讨BHE基因的功能特征，及其作为BCSCs生物标志物的可能性。
　　(9)利用TCGA(The Cancer Genome Altas)数据库中多种肿瘤类型的大样本转录组数据进行分析，探讨BHE基因是否具有临床相关性，以及其作为BCSCs标志物的可行性。
　　结果:
　　(1)大量群体细胞靶向深度测序揭示没有BCSCs特异性携带突变位点的证据
　　1)ALDH1流式检测结果显示，在连续成球悬浮培养的过程中，从源生细胞(2D)至由此培养的第一代(SP1)、第二代(SP2)、第三代(SP3)、第四代微球体(SP4)，BCSCs的比例逐渐增高;
　　2)WGs结果显示，部分单核苷酸变异(Simple Nucleotide Variations，SNVs)的变异频率(Variant Allele Frequency，VAF)在2D、SP1、SP4之间存在明显差异。不同样品间的VAF差异分析发现BCSCs潜在的特异性突变位点;
　　3)滑动窗口分析显示，潜在BCSCs突变位点存在显著的密集分布区域。进一步分析显示，这些位点呈现指数分布特征，利用RLE算法，寻找出54个潜在的特异性突变位点集中分布的热点区域(hotspot);
　　4)2D、SP1、SP4靶向hotspot的深度测序显示，在测序深度显著升高（平均每个位点覆盖4500×）的情况下，2D、SP1、SP4样品间靶区所有SNV位点的VAF没有变化，该结果表明基因组水平突变决定BCSCs表型的假设不成立，并未发现BCSCs携带特异性突变位点的证据。
　　(2)单细胞靶向测序证实乳腺癌肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞之间基因组水平无差异
　　1)单细胞水平靶向深度测序结果显示，平均测序深度为4000×时任意两个样品间靶区内所有位点的碱基权重的相关系数非常高，并且相关系数在组间(BCSCs对比NBCSCs)与组内（BCSCs对比BCSCs或者NBCSCs对比NBCSCs）比较没有统计学差异(P值=0.3786);而且任意两个样品间的基因组距离极小（集中在0.001附近），说明所有样品间基因组水平高度相似;
　　2)针对3个BCSCs的背景碱基数目与2个NBCSCs的噪音碱基数目进行的二项分布检验显示，WHM靶区内有764个位点可能与BCSCs相关;
　　3)针对这5个样品进行随机分组结果显示，检测出的BCSCs相关突变位点数目与分组情况无关。随着设定阈值从0.1逐渐降至0的过程中，真正分组与随机组的检测阳性位点数目均等比减少，两者的比值呈现始终不变的趋势。以上结果表明，BCSCs相关的潜在突变位点为假阳性，来源于测序噪音，BCSCs相对于NBCSCs没有基因组水平的变异;
　　4)在CHM靶区，同样证明BCSCs相对于NBCSCs无基因组水平变异。
　　(3)单细胞转录组测序显示转录组水平的差异决定自我更新能力
　　1)体外单细胞成球实验显示只有小部分单细胞生长成为微球体，说明这部分细胞具有自我更新能力;
　　2)针对5个BCSCs与3个NBCSCs进行单细胞水平转录组测序(Single Cell RNA sequencing，scRNA-seq)，并将2组表达谱数据进行GSEA结果显示，BCSCs组的表达谱相对于NBCSCs组，在“干细胞增殖调控”等干性相关功能的基因集中被显著富集，提示单细胞转录组水平的差异与肿瘤干细胞表型密切相关;
　　3)两组间差异基因表达分析，筛选出74个在BCSCs中显著高表达(BCSCs highly expressed，BHE)的基因，能够决定BCSCs的自我更新能力。这74个基因的表达谱，在多次基于大量细胞的转录组测序与scRNA-seq结果之间呈现良好相关性，验证了seRNA-seq的检测结果;
　　4)在鉴定出的BHE基因中包含已报道的肿瘤干细胞相关基因，如ALCAM、PKM、FASN、VEGFA、ADAM10、BCL2L1、CTGF、CTNNB1、PDLIM7、STS和SET。
　　(4)BHE基因可以作为BCSCs潜在的生物标志物
　　1)BHE基因的功能(Gene Ontology，GO)分析显示，BHE基因与胚胎发育、上皮细胞的迁移和细胞迁移的正向调控等功能显著相关;
　　2)功能网络富集分析显示BHE基因在生物功能上具有相关性与协同性，如细胞生物学过程的正向调控（假阳性率:0.00295）和细胞表面受体信号通路（假阳性率:0.0034）;
　　3)TCGA数据库中多种肿瘤类型的大样本患者转录组数据分析显示，大部分BHE基因在癌与癌旁组织中呈现显著差异表达的趋势，具有临床相关性，可以作为BCSCs的生物标志物;
　　4)SurvExpress数据库进行1561名乳腺癌患者预后生存分析结果显示，大部分BHE基因在乳腺癌复发高危组患者中呈现显著高表达状态;
　　5)Kaplan-Meier Plotter数据库逐一进行BHE基因的生存分析显示，大部分基因与乳腺癌的不良预后呈现显著相关性;
　　6)PRECOG数据库评估BHE基因在不同肿瘤类型中的预后相关性，结果显示BHE基因对于神经母细胞瘤的预后影响最大。
　　结论:
　　(1)在全基因组范围内，乳腺癌肿瘤干细胞相对于非肿瘤干细胞未携带特异性突变。
　　(2)BCSCs的身份特性及表型并非由基因组水平决定。
　　(3)乳腺癌在单细胞层面表现出的转录组水平的可变性决定了细胞命运，即转变为具有自我更新能力的肿瘤干细胞。
　　(4)决定BCSCs表型的转录组特征，包括74个协同作用的高表达基因。这些基因具有显著的临床意义，与肿瘤的转归、预后密切相关，可作为潜在的BCSCs生物标志物。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

1．1 细胞系

1．2 仪器设备

2 方法

2．1 细胞培养

2．2 体外微球体悬浮培养

2．4 基于大量细胞的全基因组测序和数据分析

2．5 基于大量细胞的靶向测序和数据分析

2．6 单细胞靶向DNA测序

2．7 单细胞转录组测序分析(single cel l RNA sequencing，scRNA-seq)

结果

一、靶向深度测序揭示BCSC无特异性突变位点

1、连续成球实验富集BCSC

2、全基因组测序初步筛选BCSC特异性突变位点集中区域

3、靶向深度测序揭示BCSC无特异性突变位点

二、单细胞靶向测序证实BCSC与NBCSC之间基因组水平无差异

1、单细胞基因组靶向测序概况

2、单细胞测序结果初步分析显示BCSC与NBCSC基因组水平相似度极高

3、利用二项分布模型系统性评估BCSCs与NBCSCs间是否存在基因组水平差异

三、单细胞转录组水平的差异决定BCSC表型

1、单细胞转录组测序与基因集富集分析

2、BCSC与NBCSC差异基因表达分析

四、BHE基因作为BCSC标志基因的探索

2、BHB基因的临床相关性

3、BHE基因的临床预后意义

讨论

结论

参考文献

综述

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢