邻苯二甲酸-单-乙基己脂引起EA.hy926细胞自噬依赖性凋亡的实验研究

摘要

目的：邻苯二甲酸二乙基己酯(Di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)作为一种增塑剂被广泛应用于食品包装和医疗设备，且年产量巨大（近三百万吨）。邻苯二甲酸酯能够很轻易地迁入人体体液中，血袋和静脉输液管等很可能是人类接触DEHP的重要途径。邻苯二甲酸-单-乙基己酯(Mono-(2-ethylhexyl)phthalate，MEHP)是DEHP的一种活性代谢产物。大量研究表明，MEHP具有生殖系统毒性、泌尿系统毒性、肝脏毒性、生长发育毒性和致癌性，但是对于心血管毒性的探究却不多见，其作用机制也不明确。
　　近年来，随着对自噬研究的深入，发现细胞自噬是细胞对细胞器及长半衰期蛋白质进行降解并予以回收再利用的一种细胞生存机制，被称为Ⅱ型程序性死亡，区别于细胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）。虽然二者从形态学和代谢途径等方面存在差别，但是，越来越多的研究表明，自噬和凋亡之间的信号转导通路存在广泛交联。有研究表明，MEHP会引起一些细胞发生凋亡。所以本实验以人脐静脉内皮细胞EA.hy926为研究对象，探究MEHP是否可以引起溶酶体膜通透性增加(Lysosomal membrane permeabilization，LMP)，以及LMP在MEHP介导的凋亡中的作用。同时，还将探宄MEHP引起的自噬和凋亡之间的相互关系。
　　方法：不同浓度（0-800μM）的MEHP处理EA.hy926细胞后，用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞生存率的变化;选择200μM的MEHP在不同时间点(0h、3h、6h、12h、24h)处理EA.hy926细胞，用western blot（蛋白质免疫印迹）法检测EA.hy926细胞LC3、cathepsin B、cytochrome c、caspase3蛋白表达量的变化;AO染色后用Olympus BX-63荧光显微镜观察MEHP对EA.hy926细胞溶酶体膜稳定性的变化;JC-1染色后用荧光显微镜观察MEHP对EA.hy926细胞线粒体跨膜电位的变化;TUNEL染色标记后用荧光显微镜观察MEHP是否引起EA.hy926细胞发生凋亡。1mM3MA对细胞进行预处理2h后，研究在MEHP处理的细胞中，自噬与LMP、线粒体外膜的通透性增加(Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)和细胞凋亡的相互关系。10μM CA-074Me对细胞进行预处理2h后，研究组织蛋白酶B在MEHP所致MOMP和细胞凋亡中发挥的作用。
　　结果：EA.hy926细胞经不同浓度（0-800μM）的MEHP处理24h后，细胞的生存率随着MEHP浓度的增加而显著降低。200μM的MEHP在0h、3h、6h、12h、24h各时间点处理EA.hy926细胞后发现，从6h开始，细胞中LC3-Ⅱ蛋白的表达量明显增多，且具时间依赖性;而在3h时，细胞中LC3-Ⅱ蛋白水平并没有明显变化。MEHP处理细胞12h后，荧光显微镜观察到溶酶体膜通透性明显增加，且组织蛋白酶B的释放量也从12h开始显著增多;而经3MA预处理后，LMP和组织蛋白酶B的释放情况得到明显缓解。同时，通过荧光显微镜观察发现MEHP处理细胞12h后，线粒体跨膜电位明显降低，细胞色素c的释放量也开始增多;同样地，经3MA和CA-074Me预处理后，MOMP和细胞色素c的释放情况明显得以缓解。TUNEL标记染色后发现EA.hy926细胞在MEHP处理12h时开始凋亡，western blot检测到caspase3蛋白表达量也是12h开始明显增多;经3MA和CA-074Me预处理后，细胞凋亡情况有所缓解。
　　结论：MEHP可引起EA.hy926细胞发生自噬依赖性凋亡，且MEHP通过激活自噬，引起LMP，溶酶体释放组织蛋白酶B，通过溶酶体-线粒体途径，进而导致MOMP，细胞色素c释放增加，最终引起凋亡。

目录

声明

摘要

(一)前言

(二)材料和方法

1．材料

1．1 实验对象、药品和主要试剂

1．2 主要仪器

2．方法

2．1 细胞培养和处理

2．2 MTT实验

2．3 蛋白质印迹实验(Western blot)

2．4 AO染色检测溶酶体膜稳定性

2．5 JC-1检测线粒体膜电位

2．6 TUNEL染色检测细胞凋亡

2．7 统计方法

(三)结果

1．MEHP对细胞活性的影响

2．MEHP诱导EA．hy 926细胞发生自噬

3．MEHP引起LMP

4．MEHP引起组织蛋白酶B释放增加

5．MEHP引起细胞线粒体膜电位下降

6．MEHP引起细胞色素c蛋白表达量增加

7．MEHP诱导EA．hy 926细胞自噬依赖性凋亡

8．CA-074 Me对细胞色素c的释放和细胞凋亡的影响

(四)讨论

(五)结论

参考文献

三、综述 自噬与凋亡的相互关系及其在心血管疾病中的作用研究进展

四、攻读学位期间发表论文情况

致谢