影响果蝇肠道干细胞增殖与分化的lncRNAs的筛选及其功能分析

摘要

组织稳态需要死细胞的去除和新细胞的产生之间保持良好平衡。因为摄入的食物、病原体和毒素会损伤上皮，胃肠道依赖于不断的自我更新来维持稳态。成体肠道干细胞(intestinal stem cells，ISCs)可以产生肠道上皮的所有成熟细胞类型，在该过程中任何不平衡都可导致疾病的发生。在成年哺乳动物小肠中，ISC细胞群靠近肠腺隐窝底部，每个隐窝每天约产生300个细胞。这个过程由每个隐窝的4～6个ISCs支持，ISCs迁移到隐窝中，经历转运扩增分裂，分化为肠绒毛的主要成分——肠吸收细胞。许多经典的信号通路包括Notch、BMP和Wnt，已被证明在增殖过程中起关键作用。然而，由于缺乏特定的干细胞标记，直到现在也难以精确鉴定和研究这个细胞群。
　　果蝇与哺乳动物的肠道在发育、细胞组成和遗传控制方面具有很大的相似性，在肠道病理生理学和再生以及控制它们的信号传导途径之间具有相当的保守性。成年果蝇肠道干细胞的发现为研究肠道干细胞生物学提供了一个新的模型系统。果蝇ISC细胞核小，可特异性表达Notch的配体Delta。ISC进行自我更新产生一个新的ISC和一个未分化成熟的中间过渡细胞(enteroblasts，EBs)，ISCs和EB细胞都可以表达Snail/Slug家族的转录因子escargot(esg)。EB细胞可分化为具有吸收营养物质功能的肠上皮细胞(enterocytes，ECs)和肠内分泌细胞(enteroendocrme cells，EEs)，ECs有大的细胞核，被Pdm1(Nubbin)标记，EE细胞可被Prospero标记。研究果蝇肠道干细胞的自我更新和分化调控机制可以为人类或其它脊椎动物的肠道干细胞的增殖与分化研究提供更多线索。根据现阶段的研究进展，知道稳态及再生条件下Wnt、Notch、EGFR、JAK-STAT信号通路对肠道干细胞的增殖及分化起着重要的调控作用。通过RNAi果蝇系高通量筛选，研究人员已筛选到405个蛋白编码基因参与调控果蝇肠道干细胞的增殖与分化。近年来长非编码RNA受到普遍关注，目前已经发现了上千个IncRNAs，其在表观遗传、转录及转录后方面发挥着关键的调控作用。非编码RNA是否参与肠道干细胞增殖与分化的调控过程尚不清楚。
　　利用来自清华大学高冠军教授实验室构建的82株lncRNAs敲除果蝇株，与esg-Gal4果蝇通过遗传杂交整合在同一株果蝇中。esg可驱动GFP或DsRed在ISC/EB细胞中表达，在lncRNA突变的背景下，观察GFP或DsRed标记的ISC/EB细胞数目及大小的改变。共得到70株整合果蝇株，其中X染色体5株，Ⅱ染色体36株，Ⅲ染色体29株。其中15个lncRNAs在肠道中表达，包括X染色体2个，Ⅱ染色体8个，Ⅲ染色体5个。生理条件下进行筛选，发现70个lncRNAs均不影响肠道干细胞的增殖;使用Prospero抗体染色筛选了15株整合果蝇株，均不影响肠道干细胞向EE细胞分化。DSS(dextran sulphate sodium)是葡聚糖的聚阴离子衍生物，喂食果蝇可造成肠道损伤，促使肠道干细胞增殖补充受损细胞。利用5％DSS喂食果蝇2天，发现CR43282敲除果蝇中肠道干细胞的数目与对照相比是减少的，表明在果蝇肠道再生条件下，CR43282影响肠道干细胞的增殖。根据lncRNA敲除果蝇构建原理绘制染色体定位图，发现CR43282突变果蝇株同时敲除了CR43282和CR46040。随后通过单只果蝇PCR及基因测序证实了该结果。为了反向验证CR43282和CR46040的功能，需要分别过表达CR43282和CR46040，所以构建了CR43282和CR46040转基因质粒。另一方面，通过PH3染色发现CR43282/CR46040敲除果蝇株ISC/EB细胞数目的减少是由于ISC的增殖受到抑制，表明肠道再生时CR43282/CR46040参与ISCs的增殖过程。lncRNA对果蝇肠道干细胞的调控还未有过报道，本研究通过对影响果蝇肠道干细胞增殖与分化的lncRNAs的筛选，为进一步揭示肠道干细胞增殖与分化的调控机理提供了帮助。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．材料

1．1 果蝇品系

1．2 生化试剂

1．3 缓冲液

1．4 实验仪器

1．5 引物

1．6 软件及网站

2．实验方法

2．1 影响肠道干细胞增殖与分化的lncRNA突变果蝇筛选策略

2．2 整合果蝇株建立

2．3 果蝇肠道解剖

2．4 DAPI染色

2．5 抗体染色

2．6 荧光显微镜观察肠道

2．7 PH3染色

2．8 DSS喂养实验

2．9 果蝇培养基的配制

2．10 LB液体培养基及LB平板的配制

2．11 单只果蝇PCR

2．12 果蝇基因组的提取

2．13 CR43282，CR46040转基因质粒构建

结果

2．生理条件下的筛选结果

3．Prospero抗体染色

4．DSS处理条件下lncRNAs的筛选

5．CR43282突变果蝇敲除区域分析

6．DSS处理条件下CR43282／CR46040参与肠道干细胞的增殖

7．CR43282和CR46040转基因质粒的构建

讨论

结论

参考文献

综述 果蝇肠道干细胞增殖与分化的机制及其研究进展

附录

致谢