蛋白质O-岩藻糖基化调控子宫内膜蜕膜化的机制研究

摘要

目的:
　　子宫内膜蜕膜化是子宫间质在各种激素的刺激下增殖和分化形成的一种特殊组织，指排卵后，由于激素水平改变，发生间质重构过程，其中包括子宫内膜基质细胞转变为蜕膜细胞。子宫内膜蜕膜化对妊娠的建立和维持十分重要。蛋白质糖基化是蛋白质重要的翻译后加工和修饰方式，分为N-糖基化和O-糖基化，参与了多种生理和病理过程，其中包括了胚胎植入过程等。着床糖生物学研究表明:蛋白质糖基化与子宫内膜接受性等生殖功能相关。蛋白质岩藻糖基化是蛋白质糖基化作用的一种重要形式，对于子宫内膜功能有重要意义。然而，由特异的蛋白质O-岩藻糖基转移酶(poFUTs，protein O-fucosyltransferases)催化的O-岩藻糖基化在子宫内膜蜕膜化过程中的作用分子机制尚未清楚。本论文旨在探讨蛋白质O-岩藻糖基化对子宫内膜蜕膜化的影响及其作用机制。
　　方法:
　　1.通过免疫组化检测人正常未孕（增生期/分泌期）、正常早孕组织中poFUT1的表达。
　　2.对基质细胞进行蜕膜化诱导，利用qRT-PCR、ELISA、Western blot、免疫荧光方法检测基质细胞蜕膜后poFUT1基因和蛋白的表达。
　　3.调控poFUT1，利用Western blot和免疫荧光检测蜕膜标志物的表达。
　　4.利用Western blot、CCK-8和免疫荧光检测蜕膜后，poFUT1对细胞增殖能力的影响。
　　5.通过蛋白质免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）和Western blot检测poFUT1是否可以影响Notch分子上的O-岩藻糖基化以及Notch的O-岩藻糖基化改变对Notch通路的影响。并通过Notch信号通路进一步研究poFUT1对子宫内膜蜕膜化的调控作用。
　　6.对受孕小鼠宫角注射poFUT1-siRNA，通过免疫组化进一步验证poFUT1在体内对小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的作用。
　　结果:
　　1.收集临床样品包括人正常未孕（增生期/分泌期）和正常早孕组织，通过免疫组化结果分析得到:poFUT1在人子宫内膜组织中增生期、分泌期、早孕期poFUT1表达依次增高。
　　2.在基质细胞蜕膜化过程中poFUT1的表达增加。通过雌二醇(E2)，甲羟孕酮17-乙酸酯(Medroxyprogesterone17-acetate，MPA)，和双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP，dbcAMP)联合使用对基质细胞进行蜕膜化诱导，进行形态学、qRT-PCR、ELISA、Western blot、免疫荧光分析，结果显示，细胞从长梭形变为圆形，蜕膜化的标志物PRL和IGFBP1的表达水平升高，证明基质细胞已转变为蜕膜细胞。对其进行qRT-PCR、Western blot、免疫荧光实验，结果显示:与对照组比，基质细胞蜕膜化后poFUT1的表达升高。
　　3.poFUT1促进基质细胞蜕膜化。Western blot结果显示:与对照组比，转染poFUT1-siRNA后PRL和IGFBP1的表达水平降低，当转染poFUT1-cDNA后，PRL和IGFBP1的表达水平明显升高。免疫荧光实验结果与之一致。
　　4.poFUT1通过激活细胞周期蛋白，从而促进基质细胞增殖能力。Western blot结果显示:与对照组比，转染poFUT1-siRNA，细胞增殖核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(cyclinD1、CDK2、CDK6)的表达水平降低，转染poFUT1-cDNA，细胞中PCNA和细胞周期蛋白的表达水平升高。CCK-8结果显示:转染poFUT1-siRNA组的细胞生长速度慢于对照组细胞，而转染poFUT1-cDNA后，细胞的生长速度显著高于对照组。免疫荧光实验结果与之一致。
　　5.poFUT1通过上调Notch分子上的O-岩藻糖基化，激活Notch信号通路从而促进子宫内膜蜕膜化。Western blot结果显示:细胞蜕膜化后，总蛋白的O-岩藻糖表达上调，当转染poFUT1-siRNA则下调O-岩藻糖的表达，转染poFUT1-cDNA，O-岩藻糖表达上调。IP结果显示:用Notch1抗体进行IP，与对照组比，转染poFUT1-siRNA，Notch1上的O-岩藻糖和其配体Jagged-1表达下调;转染poFUT1-cDNA，它们的表达上调;而转染poFUT1-mutant，它们与对照组比未见明显变化。证明Notch1上的O-岩藻糖表达对Notch通路产生影响。同时Western blot结果显示:当加入Notch信号通路抑制剂时，PRL和IGFBP1的表达下调。
　　6.小鼠宫角注射poFUT1-siRNA后小鼠子宫内膜蜕膜化受到抑制，胚胎着床率降低。通过免疫组化实验证明:当小鼠宫角注射poFUT1-siRNA后，IGFBP1和PCNA表达均明显下降。
　　结论:
　　1.poFUT1在人子宫内膜组织中增生期、分泌期、早孕期poFUT1表达依次增高。
　　2.基质细胞蜕膜化过程中poFUT1表达水平增加。
　　3.poFUT1促进基质细胞增殖。
　　4.poFUT1通过上调Notch分子上的O-岩藻糖基化，激活Notch信号通路从而促进子宫内膜蜕膜化。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

3．poFUT1对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响

4．poFUT1对蜕膜细胞增殖能力的影响

5．poFUT1通过上调Notch分子上的O-岩藻糖基化，激活Notch信号通路从而调控子宫内膜蜕膜化

6．小鼠体内实验

讨论

结论

参考文献

综述 蛋白质岩藻糖基化生物学功能的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢