三叉神经节TLR4信号通路参与TMJI神经免疫反应的作用研究

摘要

目的：
　　颞下颌关节炎症（Temporomandibular Joint Inflammation，TMJI）导致关节组织的退化性疾病，表现为关节疼痛、滑膜炎症、软骨的进行性退变及软骨下骨的重塑等。TMJI病因复杂、并与多因素相关。研究证明，神经因素对颞下颌关节炎症以及痛觉过敏的发生、发展与预后起到重要作用，并且多种细胞因子和疼痛相关因子参与这种炎症反应和痛觉过敏过程。Toll样受体4(Toll-like Receptors4，TLR4)是一种模式识别受体，与许多免疫和炎症性疾病的发生及发展相关。TLR4信号通路在神经病理性疼痛、糖尿病、肥胖等多种疾病中逐渐成为新的研究热点。进一步研究发现，初级感觉神经元中TLR4的表达，可以发挥神经元潜在的先天性免疫监测功能，对急性伤害反应应答和维持慢性疼痛状态均具有重要的作用。本课题组前期研究结果表明，三叉神经节(Trigeminal Ganglion，TG)中的巨噬细胞参与口颌面部炎症与神经损伤反应，但对其作用机制还了解甚少。最新的研究表明，TLR4信号转导对巨噬细胞的迁移及表型改变具有重要的影响作用，且靶向调控TLR4可能成为操纵巨噬细胞的有效手段。因此本实验利用完全弗氏佐剂(Freund's Adjuvant Complete，CFA)关节腔内注射法建立大鼠颞下颌关节炎动物模型，观察大鼠TMJI过程中，巨噬细胞、TLR4及其信号通路在TG中的动态表达变化，探讨神经系统TLR4信号通路参与TMJI神经免疫反应的作用，并进一步解析其可能机制，为TMJI的治疗提供新的参考靶点。
　　材料和方法：
　　选取由大连医科大学重大疾病基因工程模式动物研究所提供的成年雄性Sprague-Dawley大鼠33只随机分组，于颞下颌关节上腔注射CFA，建立TMJI实验动物模型，正常对照组（na(ǐ)ve组）大鼠不做任何处理。建模后72小时至6周，分别选取5个时间点进行观察检测。用于组织切片组大鼠经多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌流固定后，制备TG及TMJ连续组织冰冻切片。用于PCR实验组大鼠按TRIZOL-A+总RNA提取步骤提取TG组织总RNA。应用HE染色、免疫组织化学染色、RT-qPCR(Real time quantitative PCR)等实验方法分别检测TMJI病理进程，TG中CD206、TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB、TNF-a等因子的蛋白及基因表达。
　　结果：
　　1.组织病理学检查可见，关节腔内注射CFA后，TMJ出现进行性组织病理变化。注射CFA72h后，TMJ滑膜增生，且滑膜皱褶明显增多;6w后髁突软骨细胞层次紊乱，局部纤维软骨剥脱，出现骨质缺损。提示成功构建大鼠TMJI模型。但是，锥体束CT(CBCT)影像学检查结果显示，CFA诱发TMJI后6w后，髁突表面未见明显的骨质缺损。
　　2.免疫组织化学染色结果显示，na(ǐ)ve组和实验组大鼠TG内都存在CD206标记的M2型巨噬细胞，散在分布于TG内，多围绕于神经元细胞体的周围。统计学分析结果显示，CFA诱发TMJI后，单位面积内CD206免疫阳性细胞数显著增加，在CFA致炎72h后升高，2w达到峰值，持续至4w,于6w后趋于正常水平。
　　3.TLR4免疫组化标记结果显示，TLR4阳性信号主要分布在TG的中、小型感觉神经元的细胞膜和细胞浆中。TLR4阳性细胞率统计学分析结果显示，CFA诱发TMJI后，TLR4免疫阳性神经元细胞数量显著增加，在72h达到峰值，持续至2w，于4w时恢复至正常水平，6w时再次显著增加。
　　4.MyD88免疫组化标记结果显示，MyD88阳性信号主要分布在中、小型感觉神经元的细胞膜和细胞浆中。MyD88阳性细胞率统计学分析结果显示，CFA致炎72h后，MyD88免疫阳性神经元细胞数显著增加，在2w达到峰值，持续至4w，于6w时恢复至正常水平。
　　5.TG神经元中TLR4与MyD88表达的相关性分析结果显示，TLR4、MyD88之间相关性r=0.392。r大于0.3小于0.5，两变量具有低度相关性且具有统计学意义。
　　6.RT-qPCR检测结果显示，CFA致炎后72h到6w，TG内TLR4mRNA的表达均显著高于正常对照组，与na(ǐ)ve组相比差异具有统计学意义(p＜0.0001);同时，CFA致炎后72h及6w，TG内mRNA水平的NF-κB表达高于正常对照组，而TNF-α的表达在CFA致炎后2w至6w，均高于正常对照组，差异具有统计学意义(p＜0.01)。而TG内TRIFmRNA的表达仅在6w时高于na(ǐ)ve组(p＜0.01)。
　　结论：
　　1.三叉神经节TLR4信号通路参与TMJI神经免疫反应。
　　2.TMJI病理进程，TG中TLR4的激活主要通过MyD88依赖途径信号转导。
　　3.TG中M2型巨噬细胞参与TMJI神经炎症及修复过程。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

3．数据采集

4．统计学分析

结果

一、大鼠TMJI动物模型的成功建立

二、TG神经元内CD206、TLR4、MyD88的动态表达

三、CFA诱发TMJI后TG中各因子在mRNA水平的表达变化

讨论

3．TLR4信号转导通路在TMJI后TG中的参与作用

4．M2型巨噬细胞参与颞下颌关节炎的感染及神经损伤的修复过程

结论

展望

参考文献

综述 TLR4信号通路最新研究进展

攻读学位期间发表论文情况

缩略语表

致谢