百合遗传转化体系建立及转ACC合酶反义基因的研究

摘要

延长百合花朵的寿命已成为近20年来专家们研究的主要课题之一，研究表明，抑制乙烯的生物合成是延缓切花衰老的有效途径。 本文以东方百合“西伯利亚”、“索邦”和铁炮百合为研究材料，通过外植体再生和抗生素筛选实验确定了百合遗传转化受体系统，利用GUS基因和ACC合酶反义基因对“西伯利亚”进行了根癌农杆菌介导的遗传转化，从而建立了高效稳定的百合遗传转化体系。 百合鳞片在诱导愈伤组织、不定芽及生根的能力上有一定的差异，“西伯利亚”的再生能力最强，其次为“索邦”、铁炮百合。在含有0.2、0.5mg/L6-BA和0.5～2.0mg/L2，4-D或0.1、0.2mg/LNAA的MS培养基中，3个品种都能高效再生。抗生素筛选实验结果表明，50～100mg/L卡那霉素或7.5～10mg/L潮霉素浓度范围对百合愈伤组织和鳞片效果较理想。 在建立“西伯利亚”农杆菌介导的遗传转化体系中，农杆菌侵染愈伤组织外植体转化效率较高；乙酰丁香酮(AS)的添加能大大提高根癌农杆菌转化百合的效率；LBA4404菌株的侵染效果好于GV3101菌株。另外，预培养时间、农杆菌浓度、侵染时间、及共培养时间均对转化效率有一定的影响，转化材料在OD600为0.4的菌液中侵染15min，共培养2～3天转化效率最高。筛选后获得的抗性植株经PCR检测和GUS组织化学染色证实外源基因已经整合到基因组DNA中并获得表达，转化频率为5﹪～8﹪。 利用ACC合酶反义基因对“西伯利亚”遗传转化获得了9株转化植株，经PCR检测其中2株呈阳性，初步证实了外源基因已整合进百合基因组中，从而证实了所建立的转化系统的可应用性。

目录

文摘

英文文摘

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引 言

1文献综述

1.1百合花卉采后衰老生理

1.1.1百合花卉的利用价值

1.1.2百合产业发展及经济效益

1.1.3百合花卉采后衰老生理

1.1.4 乙烯与百合切花衰老的关系

1.2 乙烯生物合成和ACC合酶基因研究进展

1.2.1 乙烯的生物合成

1.2.2 ACC合酶基因的克隆及其表达

1.2.3 ACC合酶反义基因的转化研究

1.3百合组织培养研究进展

1.3.1百合外植体的选择

1.3.2百合组织培养中形态发生途径

1.3.3激素对百合组培的影响

1.3.4百合组培苗的生根和移栽

1.4百合遗传转化研究进展

1.4.1百合转化体系的建立

1.4.2转基因百合的研究现状

1.4.3影响农杆菌遗传转化率的主要因素

1.4.4遗传转化的问题与展望

1.5本课题的研究内容和意义

2百合农杆菌介导的遗传转化受体系统的建立

2.1材料

2.2方法

2.2.1技术路线

2.2.2初代培养物的建立

2.2.3百合愈伤组织的诱导与植株再生

2.2.4抗生素抗性筛选

2.2.5组培苗继代培养与快速繁殖

2.2.6百合子球的增大

2.3结果与分析

2.3.1百合愈伤组织的诱导

2.3.2百合不定芽的诱导

2.3.3不同培养基对百合生根的影响

2.3.4抗生素抗性筛选实验

2.3.5百合子球增大实验

2.4讨论

3农杆菌介导东方百合“西伯利亚”遗传转化体系的建立

3.1材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌株和质粒

3.2方法

3.2.1植物材料的获得

3.2.2农杆菌的培养及工程菌的制备

3.2.3转化、筛选和植株再生

3.2.4农杆菌双元载体质粒的提取

3.2.5 GUS组织化学染色

3.2.5抗性植株的PCR分析

3.3结果与分析

3.3.1影响农杆菌介导百合遗传转化效率的诸因素

3.3.2再生植株的GUS染色和PCR检测

3.4讨论

4 ACC合酶反义基因转化东方百合“西伯利亚”的研究

4.1材料

4.1.1植物材料

4.1.2菌株和质粒

4.2方法

4.2.1农杆菌感受态细胞的制备、转化及鉴定

4.2.2转化及筛选

4.2.3 PCR检测

4.3结果与分析

4.3.1农杆菌转化及转化菌的PCR检测

4.3.2转化植株的获得

4.3.3转化植株的检测

4.4讨论

5结论与展望

5.1结论

5.2创新点

5.3有待进一步开展的工作

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致 谢