姜黄素体外抗癌作用与IGF-1通路的关系及其机制研究

摘要

姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的酚类色素，药理作用广泛。近年来的研究表明姜黄素能防止小鼠及大鼠多种组织中肿瘤的发生，并能抑制人类多种肿瘤的增殖。美国国立肿瘤所(NCI)已将其列为第三代癌化学预防药。姜黄素不仅能够抑制肿瘤细胞的生长，阻遏细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡、分化以及抑制肿瘤组织的侵袭和转移，还可通过调节多种信号途径影响细胞增殖。但是，姜黄素抗肿瘤机制较为复杂，至今仍未完全阐明。因此，有关姜黄素在肿瘤预防和治疗中的作用及其机制值得深入研究。 细胞信号转导系统控制着细胞的所有活动，参与细胞所有的生理和病理过程，细胞信号转导系统异常在肿瘤发生和发展的各个阶段都具有重要意义。胰岛素样生长因子-1及其信号通路在肿瘤的发生发展中起着十分关键的作用。IGF-1系统(或称IGF-1通路)包括IGF-1和IGF-2两种肽类激素，多种细胞膜受体，如IGF-1受体(IGF-1R)，以及至少7种与IGF有高度亲和力的结合蛋白(IGFBPs)。IGF-1R在多种肿瘤组织和细胞中过度表达，既能作为肿瘤发生的诊断标记，也是一个具有广泛运用前景的肿瘤治疗靶点。本论文的主要研究目的在于明确姜黄素体外抗癌作用与IGF-1通路的关系及其作用机制。 本研究采用不同组织来源的人癌细胞株HT-29细胞，MCF-7细胞，PC-3细胞和Hela细胞以及正常人血管内皮细胞株ECV-304细胞作为体外模型，检测了姜黄素的抗细胞增殖活性，结果显示姜黄素对上述五种细胞株均具有抑制增殖作用，但对不同组织来源的细胞其抑制强度不尽相同，其中对人结肠癌HT-29细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用较强，而Hela细胞对姜黄素最不敏感，表明姜黄素抑制细胞增殖作用可能具有组织特异性，但未见明显的肿瘤细胞选择性。 细胞毒性作用是姜黄素抗癌作用的一个方面。通过检测HT-29细胞培养基上清中乳酸脱氢酶释放率来考察姜黄素的细胞毒性作用。结果表明浓度超过40 μM的姜黄素作用48 h以上，具有明显的细胞毒性作用。采用形态学观察、碘化丙啶(PI)单染色及AnnexinV-FITC和PI双染色流式细胞仪技术检测姜黄素诱导HT-29细胞凋亡作用。结果显示姜黄素能够阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制肿瘤细胞S期的DNA合成，诱导HT-29细胞凋亡。进一步研究显示，姜黄素可导致线粒体膜电位下降，提高线粒体膜的通透性，促使细胞色素C从线粒体向胞液中释放，抑制Bcl-2蛋白表达，同时提高Bax蛋白表达水平，并激活Caspase-3，最终导致细胞凋亡。 以HT-29细胞和MCF-7细胞作为体外模型，分析姜黄素对外源性IGF-1促增殖及抗凋亡作用的影响。MTT分析结果显示，外源性IGF-1能促进HT-29和MCF-7细胞增殖，并抑制其凋亡，而姜黄素则能明显抑制IGF-1的促增殖及抗凋亡作用。姜黄素能够干预IGF-1通路，主要表现为抑制内源性IGF-1的合成与分泌，促进IGFBP-3的分泌，抑制IGF-1介导的RTK激活，并在mRNA水平和蛋白水平上抑制IGF-1R表达。本研究还初步明确了姜黄素对IGF-1R介导的PI-3K/Akt途径和MAPK/Erkl/2信号传导途径的影响，结果显示姜黄素不仅能够显著降低IGF-1诱导的p-IGF-1R水平，抑制IGF-1R的激活，而且还能够抑制IGF-1诱导的Akt和Erk1/2蛋白磷酸化，降低p-Akt和p-Erk1/2水平，初步表明姜黄素可以通过抑制IGF-1R介导的P13K/Akt和MAPK/Erk1/2信号途径而发挥抗癌作用。 PPAR<,γ>是配体激活转录因子，在多种肿瘤细胞中表达，经特异性激动剂作用后，在调控肿瘤细胞分化，增殖，凋亡等方面发挥重要作用。本研究初步探讨了姜黄素调控IGF-1R表达与PPAR-γ途径的依赖关系。结果证实姜黄素不仅可通过激活PPAR-γ途径抑制HT-29细胞生长，还可通过激活PPAR-γ途径下调IGF-1R的表达。对PPAR-γ本身来说，姜黄素可明显提高其蛋白表达水平，但对PPAR-γ mRNA含量并无显著影响。 总之，本研究不仅证实了姜黄素可以通过细胞毒作用、诱导凋亡作用使肿瘤细胞生长停滞并逐渐走向死亡，而且首次明确姜黄素体外抗癌作用与IGF-1通路的关系，初步阐明姜黄素干预IGF-1通路的作用及其作用机制。这将为姜黄素在人类癌的治疗和化学预防中的实际应用提供新的理论依据，也将为新型抗癌药物的研发提供一个新思路。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

1.文献综述

1.1姜黄素的研究现状

1.1.1姜黄素的生物学特性

1.1.2姜黄素的抗癌活性

1.1.3姜黄素的抗癌作用机制

1.1.4姜黄素的其它药理作用

1.1.5姜黄素的安全性

1.2胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)及其信号转导与肿瘤

1.2.1 IGF-1系统简介

1.2.2 IGF-1R的生化特性

1.2.3 IGF-1R的表达调控

1.2.4 IGF-1R信号转导机制及其调控

1.2.5 IGF-1R与肿瘤关系的研究进展

1.2.6 IGF-1R与肿瘤信号转导干预治疗

结 语

参考文献

2.姜黄素对人癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

2.1材料与设备

2.1.1细胞株

2.1.2实验试剂

2.1.3实验设备

2.2试验方法

2.2.1细胞培养

2.2.2 MTT比色法分析细胞活力

2.2.3乳酸脱氢酶释放的测定

2.2.4电镜观察细胞超微结构

2.2.5 PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布

2.2.6 Annexin V-FITC和PI双染色FCM分析细胞凋亡

2.2.7线粒体膜电位的测定

2.2.8细胞色素C释放的测定

2.2.9分光光度法测定Caspase-3的活性

2.2.10 FCM分析Bc1-2和Bax蛋白

2.2.11实时定量RT-PCR技术检测bcl-2 mRNA表达量变化

2.2.12统计学分析

2.3结果与分析

2.3.1 MTT比色法检测的结果

2.3.2乳酸脱氢酶释放率的测定

2.3.3细胞形态观察结果

2.3.4细胞超微结构观察结果

2.3.5 PI单染色FCM分析姜黄素对HT-29细胞周期分布的影响

2.3.6 Annexin V-FITC和PI双染色FCM分析凋亡

2.3.7姜黄素对HT-29细胞线粒体膜电位的影响

2.3.8姜黄素促进细胞色素C的释放

2.3.9姜黄素对Caspase-3活性的影响

2.3.10姜黄素对Bcl-2家族蛋白表达的影响

2.4讨论

2.5小结

参考文献

3.姜黄素对IGF-1促增殖、抗凋亡作用的影响及其机制研究

3.1材料与设备

3.1.1细胞株

3.1.2实验试剂

3.1.3实验设备

3.2试验方法

3.2.1细胞培养

3.2.2 MTT法分析细胞活力

3.2.3细胞周期检测

3.2.4 Annexin V-PI双染检测细胞凋亡

3.2.5放射免疫法分析细胞培养基上清中IGF-1/IGFBP3水平

3.2.6 Western blotting

3.2.7IGF-1R受体酪氨酸激酶活力的检测

3.2.8实时定量RT-PCR分析基因水平

3.2.9统计学分析

3.3结果与分析

3.3.1 IGF-1促进HT-29和MCF-7细胞生长

3.3.2姜黄素对IGF-1促细胞增殖作用的影响

3.3.3姜黄素对IGF-1抗凋亡作用的影响

3.3.4姜黄素抑制内源性IGF-1的分泌

3.3.5姜黄素促进IGFBP-3的分泌

3.3.6姜黄素对肿瘤细胞IGF-1蛋白表达的影响

3.3.7姜黄素对IGF-1R受体酪氨酸激酶活力的影响

3.3.8姜黄素对MCF-7细胞中IGF-1R表达的影响

3.4讨论

3.5小结

参考文献

4.姜黄素对IGF-1R表达及其信号转导通路的调控研究

4.1材料与设备

4.1.1细胞株

4.1.2实验试剂

4.1.3实验设备

4.2试验方法

4.2.1细胞培养

4.2.2实时定量RT-PCR分析基因水平

4.2.3 Western blotting分析蛋白表达水平

4.2.4统计学分析

4.3结果与分析

4.3.1姜黄素抑制HT-29细胞中IGF-1R基因的转录

4.3.2姜黄素下调HT-29细胞膜上IGF-1R蛋白的表达

4.3.3姜黄素对IGF-1R基因转录因子Sp1和p53的调控

4.3.4姜黄素对IGF-1R自磷酸化水平的影响

4.3.5姜黄素对IGF-1诱导的Akt蛋白磷酸化的影响

4.3.6姜黄素对IGF-1诱导的Erk1/2蛋白磷酸化的影响

4.4讨论

4.5 小结

参考文献

5.姜黄素抑制IGF-1R表达的PPAR-γ途径依赖机制初探

5.1材料与设备

5.1.1细胞株

5.1.2实验试剂

5.1.3实验设备

5.2试验方法

5.2.1细胞培养

5.2.2 MTT法分析细胞活力

5.2.3 Western blotting

5.2.4实时定量RT-PCR分析基因水平

5.2.5统计学分析

5.3结果与分析

5.3.1姜黄素、ciglitazone和15dPGJ2对HT-29细胞生长的影响

5.3.2阻断PPAR-γ途径对姜黄素抑制HT-29细胞生长作用的影响

5.3.3阻断PPAR-γ途径对姜黄素抑制IGF-1R表达的影响

5.3.4姜黄素对PPAR-γ表达的影响

5.4讨论

5.5 小结

参考文献

结论

论文创新点

攻读博士学位期间发表学术论文情况

致谢