苦参、黄芪药对配伍对病毒性心肌炎的治疗作用及机制研究

摘要

目的：
　　 探讨研究苦参、黄芪药对以苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、黄芪中黄芪甲苷和以增强小鼠免疫功能为指标确定最佳提取方法和最佳配伍比例；研究苦参、黄芪药对配伍后对苦参中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠体内血药浓度影响；苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗CVB3病毒及体外对感染CVB3病毒SD大鼠心肌细胞的保护对比实验研究；研究苦参、黄芪药对提取物对CVB3诱导Balb/c小鼠心肌炎的治疗作用；研究苦参、黄芪药对提取物对CVB3诱导Balb/c小鼠心肌炎治疗的可能机制。
　　 材料与方法：
　　 1、苦参、黄芪药对的最佳提取方法、比例的确定：苦参、黄芪药对用水分提合并、水合提取、醇分提合并、醇合提取四种提取方法，苦参、黄芪药对按生药量比例1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1、5:1混合，通过紫外分光光度法测定总生物碱、高效液相色谱法测定苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、黄芪中黄芪甲苷指标性成分和增强小鼠免疫功能影响的药效研究，确定了苦参、黄芪药对最佳提取方法、最佳配伍比例。
　　 2、苦参、黄芪药对提取物、单味药苦参提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究：分别取健康大鼠6只，雌、雄各半，取空白血浆0.5 mL后，分别灌胃给药（黄芪、苦参药对提取物和苦参提取物），于给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h，各从大鼠眼眶后静脉丛取血0.5 mL，进行血浆内苦参、黄芪药对提取物、苦参提取物中有效成分氧化苦参碱、氧化槐果碱的药代动力学分析。
　　 3、苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗CVB3病毒及体外对感染CVB3病毒SD大鼠心肌细胞的保护对比实验研究：在体外CVB3病毒感染的培养心肌细胞模型成功建立的基础上，分病毒对照组、正常细胞对照组、阳性对照药干扰素组，苦参提取物高、中、低剂量组，黄芪提取物高、中、低剂量组，苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组，分别于第2、5d时间点，在倒置显微镜下测定每孔细胞搏动速率，并进行形态学观察，吸取上清液测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量和测定药物抑制病毒滴度。
　　 4、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/c小鼠心肌炎治疗作用实验研究：纯系雄性Balb/c小鼠，4周龄（体重为12g左右），设苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组，另外设三个对照组：空白对照组、病毒对照组、玉丹荣心丸阳性对照组，每组二十只小鼠，统计小鼠死亡率，分别在第7d、14d无菌条件下取心脏，用HE染色方法观察小鼠心肌损伤、测定心肌病毒滴度。
　　 5、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治疗作用机制研究：纯系雄性Balb/c小鼠，4周龄（体重为12g左右），设苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组，另外设三个对照组：空白对照组、病毒对照组、玉丹荣心丸阳性对照组，给药14d后通过免疫组化、原位杂交方法和原位末端标记法对组织进行凋亡形态学分析，观察心肌颗粒酶B的蛋白、BCL-2基因表达，Caspase3的蛋白、基因表达，及心肌细胞凋亡情况，探索苦参、黄芪药对提取物治疗CVB3感染心肌炎的可能机制。
　　 结果：
　　 1.苦参、黄芪药对的最佳提取方法、最佳配伍比例的确定
　　 苦参、黄芪药对经乙醇合提取，用高效液相色谱法测定苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱五种生物碱的含量最高，分别为1.0128、2.9458、1.0803、0.71790、3.0960mg·g-1，黄芪甲苷含量0.11920mg·g-1，用分光光度法总生物碱含量3.1880mg·g-1，通过对小鼠免疫功能影响的研究，苦参、黄芪药对经乙醇合提对小鼠免疫功能影响明显优于与其它提取方法对小鼠的免疫功能影响。
　　 苦参、黄芪药对4:1配伍用高效液相色谱法测定苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱5种生物碱的含量较高高，分别为3.9020、10.740、2.4293、2.2400、6.9530mg·g-1，苦参、黄芪2:1配伍黄芪甲苷含量最高为0.13060mg·g-1，用分光光度法测总生物碱苦参、黄芪5:1配伍含量最高为3.4740 mg·g-1，通过对小鼠免疫功能影响的研究，苦参、黄芪药对2:1配伍比例对小鼠免疫功能影响明显优于与其它配伍比例对小鼠的免疫功能影响。在中药配伍的运用中，我们不仅要考虑单昧药物的剂量，更要注意药物用量之间的比例。通过配伍，既能增强原药物的作用，更能调和偏性，取长补短，发挥药物配伍的长处，使各具特征的药物形成一个新的有机整体，以适应复杂病症的治疗需要。在本实验中，以中医药基础理论为指导依据，以药理疗效结果为主要依据，有效成分含量为辅助指标，最终确定苦参、黄芪按生药量配伍的最佳比例为2:1。
　　 2、苦参、黄芪药对提取物、单味药苦参提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究
　　 大鼠灌胃苦参、黄芪药对提取物后的氧化苦参碱在大鼠体内的最大血药浓度为2.010μg·mL-1，达峰时间为6小时，药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为12.91小时，0-24小时药时曲线下面积为22.61mg/L*h；苦参药材中的氧化苦参碱在大鼠体内的最大血药浓度为6.526μg·mL-1，达峰时间为4小时，药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为15.70小时，0-24小时药时曲线下面积为46.50mg/L*h。将药对提取物和苦参药材提取物处理结果相比较，可得知，黄芪、苦参药对配伍后达峰时间有所延后，除MRT（药物分子在大鼠体内的平均停留时间）较苦参药材提取物大，其余统计据参数均小于苦参药材提取物。
　　 大鼠灌胃苦参、黄芪药对提取物后的氧化槐果碱在大鼠体内的最大血药浓度为3.954μg·mL-1，达峰时间为6小时，药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为8.679小时，0-24小时药时曲线下面积为43.31mg/L*h；苦参药材中的氧化槐果碱在大鼠体内的最大血药浓度为2.202μg·mL-1，达峰时间为4小时，药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为9.385小时，0-24小时药时曲线下面积为26.11mg/L*h。从统计据参数结果分析，给苦参药材的血药达峰时间为4小时，而给药对的为6小时，苦参药材明显比药对的时间短，一般会认为苦参中的氧化槐果碱吸收的较快，更易被大鼠吸收，但是从大鼠体内的最大血药浓度分析，给苦参的血药最大浓度为2.202μg·mL-1，而给药对的则是3.954μg·mL-1，药对明显高于苦参，说明药对中的氧化槐果碱比较容易被大鼠吸收。此外从AUC（药时曲线下峰面积）来看，苦参、黄芪药对明显高于苦参药材，认为苦参、黄芪药对提取物能促进氧化槐果碱的吸收。
　　 3、苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗CVB3病毒及体外对感染CVB3病毒SD大鼠心肌细胞的保护对比实验研究
　　 在第2d时，苦参提取物高剂量组，苦参、黄芪药对提取物高、中剂量组与病毒对照组有显著性差异（P<0.05），但是苦芪的高、中剂量组与苦参高剂量组没有显著性差异（P>0.05），但在第5d天时，苦参高、中剂量组和苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组与病毒对照组有显著性差异（P<0.05），并且苦参、黄芪药对提取物高、中剂量组与苦参高、中剂量组有显著性差异（P<0.05）
　　 4、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治疗作用实验研究
　　 通过死亡率统计、病毒滴定分析、病理切片结果分析在7d时，只有高剂量苦参、黄芪药对提取物组有降低死亡率、对病毒的有抑制及保护心肌作用。在第14d时苦参、黄芪药对提取物高、中、低均能对病毒的有抑制及保护心肌作用，并且有良好的剂量-效用关系。
　　 5、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治疗作用机制研究
　　 给药14d后通过免疫组化、原位杂交方法和原位末端标记法对心肌组织进行凋亡形态学分析，苦参、黄芪药对提取物能够降低心肌颗粒酶B的蛋白、Caspase3的蛋白、基因及心肌细胞凋亡情况表达，上调BCL-2基因表达，苦参、黄芪药对提取物的高、中、低剂量对蛋白、基因表达水平有显著性差异。
　　 结论：
　　 1、苦参、黄芪药对最佳提取方法为乙醇合提取，最佳配伍比例为2:1。
　　 2、苦参、黄芪药对提取物中黄芪能够促进苦参中氧化槐果碱吸收，促进氧化苦参碱转化为苦参碱而被吸收。
　　 3、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的心肌细胞的保护及抗病毒作用优于单味药苦参、黄芪。
　　 4、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/c小鼠心肌炎有治疗作用。
　　 5、苦参、黄芪药对提取物可能是通过降低心肌颗粒酶B的蛋白、Caspase3的蛋白、基因表达，及心肌细胞凋亡情况表达，上调BCL-2基因表达而对病毒性心肌炎起到一定的治疗作用。