海洋放线菌的分离鉴定及Ⅰ型聚酮合成酶基因筛选的研究

摘要

本文以大连海域星海湾、小平岛、长海县、旅顺的海泥样品为研究对象，研究了海洋放线菌的分离条件及不同培养基的使用对放线菌分离的影响，在探索出适宜分离方法的同时分离得到放线菌447株。对克隆获得的数目进行统计的结果证明，分散与差速离心法(DDC)是非常有效的样品预处理方法，与传统的稀释涂布方法相比，DDC法能获得数量多三倍的放线菌。使用16种培养基对海泥样品进行了分离，结果表明，HV培养基能获得最多的放线菌，其次分别为M2、M13、M5、M6。 以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉六种测试菌对分离得到的447株放线菌进行琼脂块法抗菌活性测试。试验结果表明，具有各类抗菌活性的菌株共197株，约占菌株的44％。对部分菌株进行形态特征、培养特征和生理生化特征的实验，选出9株放线菌进行了16S rDNA全序列分析。结果显示，9株放线菌中有2株小单孢菌和7株链霉菌。 分离得到一株放线菌S187。琼脂块法活性初筛表明，S187对六种测试菌均具有强抗菌活性；发酵液活性复筛表明S187对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌有强抗菌活性。综合形态特征、培养形态、生理生化特征、抗菌活性和16S rDNA序列分析，我们推断S187为一株新的海洋链霉菌。 选取40株具有较强抗菌活性或者特殊形态的放线菌，通过三对引物SetⅠ、SetⅡ和MDPQQRf/HGTGTr进行Ⅰ型聚酮合成酶(PKSI)功能基因KS域的PCR扩增。在得到的PCR阳性产物中，五段序列被鉴定为PKSI功能基因。氨基酸序列同源性比较结果显示，PKS101和PKS116b同来自Bacillus amyloliquefaciens FZB42的DfnJ KS域有较高的同源性(99％，70％)，PKS116与Bacillus amyloliquefaciens FZB42的BaeN KS域有98％的同源性，两外两段序列PKS187和PKS240分别与来自链霉菌的聚酮合成酶MerC和FscD的KS域有73％和98％的同源性。 本论文的研究结果表明，大连地区不同海域的海泥中蕴藏着丰富的海洋放线菌资源，很多菌种为抗菌活性物质和聚酮化合物的潜在生产菌株，本文的研究结果为进一步开发利用大连地区的海洋放线菌资源奠定了基础。

目录

文摘

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声明

引 言

1文献综述

1.1海洋放线菌的分布

1.1.1海底沉积物中的放线菌

1.1.2海洋动植物共附生的海洋放线菌

1.1.3海水中的放线菌

1.2海洋放线菌的筛选方法

1.2.1传统筛选方法

1.2.2预处理技术

1.2.3噬菌体用于分离稀有放线菌

1.3放线菌的多相分析方法

1.3.1概述

1.3.2表型信息

1.3.3基因型信息

1.3.4系统发育信息

1.4聚酮类化合物和聚酮合成酶

1.4.1聚酮类化合物

1.4.2聚酮合成酶

1.4.3聚酮合成酶的分子筛选

1.5本文研究的目的及意义

参考文献

2大连海域海泥中放线菌的分离研究

2.1引言

2.2试验材料和仪器

2.2.1样品采集

2.2.2试剂

2.2.3仪器

2.3实验方法

2.3.1海泥样品的预处理

2.3.2分散与差速离心法(DDC)

2.3.3放线菌分离培养基

2.3.4海泥中的放线菌的分离培养

2.3.5可培养放线菌的分离纯化及保藏

2.4结果与讨论

2.5小结

参考文献

3海泥样品中可培养放线菌的抗菌活性筛选

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2活性菌株筛选方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

参考文献

4活性放线菌的多样性研究

4.1引言

4.2仪器和试剂

4.2.1仪器

4.2.2试剂

4.3实验方法

4.3.1海泥样品中可培养放线菌基因组DNA提取

4.3.2放线菌16S rDNA的PCR扩增

4.3.3 PCR产物凝胶电泳

4.3.4 16S rDNA产物纯化和测序分析

4.3.5 GenBank序列号

4.4结果与讨论

4.4.1放线菌基因组DNA提取

4.4.2 16S rDNA的PCR反应结果

4.4.3 16S rDNA测序结果分析

4.5小结

参考文献

5菌种S187的鉴定

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1测试菌株

5.2.2菌株S187的抗菌活性

5.2.3菌株S187的16S rDNA序列分析

5.2.4培养、形态和生理生化试验

5.3结果与讨论

5.3.1 S187的抗菌活性

5.3.2 S187的系统发育分析

5.3.3 S187和S.chungwhensis的对比实验

5.4小结

参考文献

6可培养放线菌中Ⅰ型聚酮合成酶(PKSI)功能基因筛选

6.1引言

6.2材料和方法

6.2.1材料

6.2.2方法

6.3结果

6.3.1 Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)功能基因片段扩增结果

6.3.2 PKSI功能基因的系统发育分析

6.4小结

参考文献

结 论

创新点

工作展望

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致 谢