玻璃化冷冻对脐血造血干/祖细胞活率与生物学特征的影响及导入平衡时间的设计

摘要

脐血是造血干/祖细胞的一个重要来源，可用于临床移植来恢复患者的髓系造血功能。脐血采集后至进入临床应用前，需要优良的冷冻技术来保持造血干细胞的活性与特征。目前，除了传统的慢速冻存法外，玻璃化法逐渐成为一种颇具应用前景的低温保存技术，而良好的干细胞低温保存方案不仅要保证一定的细胞活率，同时要维持干细胞的增殖及分化能力。 本实验室在前期的研究中筛选出联合玻璃化保护剂配方，并对脐血来源的造血干/祖细胞进行了低温保存。为了评价该玻璃化冷冻方案的效果，本文首先用台盼蓝拒染法检测冻后细胞活率，并用流式细胞术测定CD34+细胞的百分含量，再对冻后的细胞进行短期的静态培养和长期的集落培养，综合考查冻后细胞的回收率与生物学特征。其次，由于导入过程是细胞发生损伤的主要环节，继而又对导入过程平衡时间进行了优化设计。实验方法主要采用显微摄像系统拍摄细胞照片，对导入过程不同时刻的细胞体积进行统计分析，并结合细胞活率的测定，确定适宜的导入平衡时间。 结果表明：玻璃化冷冻复苏后，单个有核细胞平均回收率可达到81.5±1.7％，而传统的慢速冻存法，单个有核细胞回收率仅为74.7±2.6％，两者存在显著性差异。慢速冻存组CD34+细胞的回收率为52.3％，略高于玻璃化冻存组49.7％，但两者无显著性差异。虽然，CD34+细胞的回收率无显著差异。原代细胞，玻璃化冻后细胞和慢速冷冻后细胞在72小时内的生长状态良好，扩增倍数分别为2.7，2.3和1.9倍。各组细胞进行14天集落培养，均可形成典型的BFU-E，CFU-GM和CFU-GEMM集落，各实验组无显著性差异，玻璃化冻存组的集落回收率可达到90％以上。 优化前导入平衡时间为等时间间隔，即每步导入之间均为90s，总时间为450s。细胞的体积皱缩到初始体积的35％以下，并无法有效恢复。细胞活率为88.1±3.0％。优化设计的平衡时间为前短后长的非等平衡时间间隔，即180s，180s，90s，90s和60s，总时间为600s。细胞的体积恢复至初始体积的63％，细胞活率为95.4±0.4％，具有显著提高。 采用联合玻璃化保护剂对脐血造血干/祖细胞进行玻璃化冷冻保存，可以得到较高的细胞回收率，且成活细胞的功能性保持完好。对导入平衡时间进行优化设计，提出前长后短的非等时间间隔，有效地减少了导入过程细胞损失的情况。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1文献综述

1.1脐血造血干/祖细胞

1.1.1造血干/祖细胞的定义

1.1.2造血干/祖细胞的生物学特征

1.1.3脐血造血干/祖细胞的特点和应用

1.2低温保存

1.2.1低温保存技术的发展

1.2.2低温损伤机理及其假说

1.2.3冷冻保护剂

1.2.4玻璃化技术

1.2.5造血干细胞的低温保存

1.2.6本文工作思路及主要内容

2脐血来源的造血干/祖细胞分离

2.1实验材料

2.1.1脐血来源

2.1.2实验药品与装置

2.2实验方法

2.2.1实验试剂配制

2.2.2造血干/祖细胞的分离

2.2.3台盼蓝拒染法检测细胞活率

2.2.4单个有核细胞短期静态培养

2.3结果与讨论

3玻璃化冷冻对造血干/祖细胞的活率和生物学特征的影响

3.1实验材料

3.1.1细胞来源

3.1.2实验仪器与药品

3.2实验方法

3.2.1台盼蓝拒染法检测细胞活率

3.2.2检测玻璃化冷冻过程各操作后的细胞活率

3.2.3流式细胞术检测CD34+细胞数目

3.2.4冷冻复苏后细胞生长曲线的测定

3.2.5集落培养

3.3结果与讨论

3.3.1玻璃化冷冻后单个有核细胞的回收率

3.3.2玻璃化冷冻过程各操作环节后单个有核细胞的回收率

3.3.3玻璃化冷冻后CD34+细胞的回收率

3.3.4冷冻复苏后细胞的生长曲线

3.3.5玻璃化冷冻后造血干/祖细胞的集落形成能力

4玻璃化冷冻方案导入过程中细胞体积的皱缩与恢复

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1联合玻璃化保护剂的配制

4.2.2联合玻璃化保护剂渗透压的测定

4.2.3单个有核细胞原始体积的测定

4.2.4保护剂导入过程不同时间细胞的体积测定

4.3结果与讨论

4.3.1联合玻璃化保护剂的渗透压

4.3.2单个有核细胞原始体积

4.3.3平衡时间为90s的分步导入过程中细胞体积变化

5导入过程平衡时间的优化设计

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1第一步导入联合玻璃化保护剂后细胞体积变化的测定

5.2.2第一步导入联合玻璃化保护剂后细胞活率的检测

5.2.3第二步导入联合玻璃化保护剂后细胞体积变化的测定

5.2.4第二步导入联合玻璃化保护剂后细胞活率的检测

5.2.5后续的导入过程研究

5.3结果与讨论

5.3.1第一步导入平衡时间的确定

5.3.2第二步导入平衡时间的确定

5.3.3第三步导入平衡时间的确定

5.3.4第四步导入平衡时间的确定

5.3.5第五步导入平衡时间的确定

结论

参考文献

附录A单个有核细胞尺寸统计

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢