人眼γD晶状体蛋白致病突变体生物物理化学性质及结构的研究

摘要

白内障，定义为全部或部分眼睛的晶状体混浊，可分为两大类:先天性和年龄相关性白内障。先天性白内障的患病率估计为每万新生婴儿中2.2-2.5例，其中约50％可遗传。同白内障相关的晶状体蛋白基因突变发生在所有三个晶状体蛋白家族中（α-，β-和γ-晶状体蛋白），并显示为不同的表型。目前，至少有60例遗传性白内障已被记录在案，均由单基因突变引起，相应突变氨基酸也被确定。有些人源γD-晶状体蛋白(HGD)突变体同先天性白内障有着密切联系，但是详细的突变相关性白内障形成的分子机制尚不明确。
　　基于HGD涉及到蛋白质沉淀疾病，即是白内障的形成，本论文以HGD为对象，研究三种HGD的突变体W42R，R76S和P23T的结构，折叠以及组装，探究该晶状体结构与功能之间的关系，进而阐明白内障形成的结构基础。
　　(1)部分去折叠HGD的中间体，可能使蛋白质聚集沉淀并最终导致晶状体的模糊，人源γD晶状体蛋白突变体同遗传性白内障的形成具有紧密的联系。王等人报道了来源于中国人家庭与白内障相关的γD晶状体蛋白突变体(W42R)，表现为常染色体显性遗传，突变体蛋白较HGD溶解性大大下降。解析了W42R突变体的晶体结构，分辨率1.7(A)，同HGD的晶体结构相比较只发现了微小的变化。令人感兴趣的是，W42R突变体蛋白酶水解非常敏感，表明小量部分去折叠成分的存在;核磁共振波谱实验证实并定量分析了部分去折叠成分的存在;氢/氘交换实验也揭示了部分去折叠成分同天然折叠成分之间的化学交换，只是W42R突变体的交换速度及其缓慢。同时，HGD的紫外线辐射实验，导致了蛋白分子N端区域的损伤，辐射后的蛋白对蛋白酶具有同W42R突变体相似的敏感性。所有的实验数据允许建立一个基于W42R致病机理的模型，即W42R突变体致病机理可以作为光损伤和年龄相关白内障的代表。
　　(2) R76S是一个从一个印度家庭新发现的与遗传性白内障相关的HGD突变体，在大肠杆菌中表达了该突变体蛋白，通过圆二色，荧光以及NMR确定了蛋白热稳定性和化学稳定性。出乎意料的是，R76S突变体，除了拥有较低的等电点外，在生物物理和生物化学性质方面同HGD并无明显不同，通过NMR确定的R76S突变体的液体结构，包括RDCs，弛豫测定，表面其与突变体具有近似相同的液体结构。同时，变性/复性动力学实验表明无论R76S突变体还是野生型突变体都显示了类似的被αB-晶状体蛋白抑制的经由错误折叠途径产生的沉淀。综上所述，研究结果表明结构和稳定性的变化都不是R76S突变体导致白内障产生的原因，但是，等电点的改变和相关表面电位的变化或者氨基酸残基天然性质的变化极有可能影响到R76S突变体与晶状体中其他蛋白家族的相互作用。
　　(3)与白内障相关的HGD P23T突变体具有地理上广泛分布和表型多样的特性。23位氨基酸残基的突变极大的降低了蛋白质本身的溶解性。由于缺乏P23T突变体的X-ray晶体结构数据，在分子水平上对突变体本身的理解并不充分。本论文工作首次成功解析了P23T突变体的晶体结构，P23T突变体采用P21的结晶群，每个不对称单元包含两个蛋白质分子。同野生型HGD相比，除了一些细微的差别，P23T突变体结构基本保持不变。这些细微差别包括:Trp42的侧链与不同的氨基酸残基形成了新的氢键，结果发生了小角度的转向;同时计算P23T突变体和HGD的溶液可接触表面积(SASA)，结果并无明显差异。有报道表明P23T突变体溶解度表现为温度退行性（随温度的增加溶解度降低）。在研究中，P23T突变体的溶解度显示出离子强度依赖性，发现在NaCl的存在下P23T突变体的沉淀聚集被部分抑制。综上所述，研究结果表明结构的变化并不是P23T突变体导致白内障产生的原因，但是Thr取代Pro确实改变了蛋白质分子间的相互作用。
　　综上所述，论文研究表征了W42R突变体的结构特点并揭示了其同年龄相关白内障之间的联系;排除了R76S突变由于自身蛋白-蛋白相互作用导致白内障的可能性;首次解析了P23T突变体的晶体结构。实验数据表明突变带来的HGD主要空间构象上的变化对白内障的发生并不是必要的;但是，突变确实改变了蛋白质分子在溶液中的特性，即不同突变体的变性/复性动力学，在白内障形成中扮演了至关重要的角色。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 白内障

1．1．1 晶状体(白内障发病位点)

1．1．2 白内障表型的分类

1．2 白内障的分类

1．2．1 年龄相关白内障

1．2．2 先天性白内障

1．3 白内障形成的分子机制

1．3．1 晶状体中主要的晶状体蛋白

1．3．2 晶状体蛋白突变体及相关疾病概述

1．3．3 解释白内障形成的主要模型(γD-晶状体蛋白)

1．3．4 预防或延缓白内障

1．3．5 白内障治疗的前景

1．4 本论文的选题依据和研究内容

1．4．1 选题依据

1．4．2 研究内容

2 人眼γD-晶状体W42R突变体蛋白与遗传性和老年性白内障之间的关系

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 W42R突变体蛋白的表达和纯化

2．2．2 W42R突变体蛋白质结晶

2．2．3 W42R突变体蛋白X-Ray实验数据的收集和处理

2．2．4 W42R突变体蛋白化学变性实验

2．2．5 精氨酸蛋白酶水解实验

2．2．6 UV-C辐射实验

2．2．7 核磁共振实验

2．3 实验结果

2．3．1 W42R突变体蛋白的纯化和溶解性

2．3．2 核磁共振对W42R突变体蛋白结构的研究

2．3．3 W42R突变体蛋白X-Ray晶体结构

2．3．4 W42R突变体的变性平衡实验

2．3．5 W42R突变体对蛋白水解酶的敏感性

2．3．6 NMR对变性蛋白的表征

2．3．7 HGD的UV-C辐射

2．4 讨论

2．5 小结

3 与幼年白内障相关的人眼γD晶状体蛋白R76S突变体结构与生化性质

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 R76S突变体的克隆表达与鉴定

3．2．2 圆二色(Circular Dichroism Spectroscopy)及荧光(Fluorescence Emission Spectroscopy)光谱分析

3．2．3 热变性实验

3．2．4 盐酸胍(GdnHCl)及尿素变性实验

3．2．5 等电聚焦实验

3．2．6 变性／复性动力学实验

3．2．7 浊度实验／与αB-晶状体蛋白作用实验

3．2．8 核磁共振实验(Nuclear Magnetic Resonance)

3．3 实验结果

3．3．1 R76S突变体的溶解性

3．3．2 R76S突变体的光谱结构特征

3．3．3 R76S突变体的稳定性

3．3．4 R76S突变体的等电点的测定及表面带电性质的研究

3．3．6 αB-晶状体蛋白抑制R76S突变体复性沉淀实验

3．3．7 R76S突变体同HGD的结构差异

3．3．8 R76S突变体同HGD的动力学性质比较

3．4 讨论

3．5 小结

4 人眼γD晶状体蛋白P23T突变体结构和溶解性之间的关系

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 P23T突变体的克隆表达与鉴定

4．2．2 P23T突变体蛋白质结晶

4．2．3 P23T突变体蛋白X-Ray实验数据的收集和处理

4．2．4 P23T突变体蛋白溶解度的测定

4．3 实验结果

4．3．1 P23T突变体蛋白X-Ray晶体结构

4．3．2 P23T突变体的溶解度

4．4 讨论

4．5 小结

结论

创新点摘要

未来工作展望

参考文献

附录A HGD的氨基酸序列

攻读博士学位期间发表学术论文情况

致谢

作者简介