Hainanenins基因克隆，活性鉴定及诱导癌细胞凋亡的机制初探

摘要

肿瘤是全世界死亡率最高的重大恶性疾病之一，在治疗过程中常常伴随着肿瘤的多药耐药性MDR产生、降低机体免疫力，最终导致化疗失败。克服肿瘤MDR，提高药物靶向性一直是肿瘤治疗中的难点。近来，由生物基因组编码的具有抵抗外源性微生物侵害、清除体内病变细胞活性的抗癌肽ACPs，被发现具有广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤细胞等作用。由于其抗肿瘤活性显著，分子量小，结构简单，理化性质稳定，不易产生耐药性，以及对哺乳动物正常细胞毒性较低等特点，已经成为抗肿瘤药物研发的热点。
　　本实验中，以海南湍蛙(Amolops hainanensis)为研究对象，从其背皮分泌物中直接分离得到2种活性多肽。随后利用分子生物学技术，通过构建背皮组织cDNA文库，设计引物，扩增序列，最终从31个连接产物中得到10种多肽序列，通过序列比对发现这10种多肽分属于4个家族，其中有5条高度同源的序列属于一个新的家族，并且其中一条与分泌物中纯化得到的多肽序列相同。根据物种种属名称，我们将这个家族命名为hainanenins并以序号1～5分别命名5条多肽，他们成熟肽部分都是由21个氨基酸残基组成，C末端由15位和21位的半胱氨酸连接成含有7个氨基酸残基的二硫环。
　　我们选取hainanenin-1和hainanenin-5检测了抗菌活性、抗氧化性、溶血性抑制抗肿瘤活性，结果显示:Hainanenin-1和hainanenin-5对17种细菌都有明显的抗菌活性，抗氧化性不明显，溶血性相对较高;其中Hainanenin-1对5中癌细胞都有明显的抑制生长的活性，IC50值在10～13μM之间，对乳腺癌细胞MCF-7的IC50值低至6.9μM。而对人脐静脉细胞HUVEC，抑制生长作用不明显，在其他肿瘤细胞IC50浓度范围内，可以认为对其生长无影响。扫描电镜结果显示，经hainanenin-1处理的MCF-7，细胞膜表面微绒毛断裂，质地由粗糙变得光滑，细胞形状由贴壁的梭形变成圆形，并且细胞膜发泡形成囊状结构，并最终破裂，在膜上形成孔洞，破坏细胞膜的完整性;细胞早期凋亡时，细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻，可与膜染料AnnexinⅤ-FITC结合，连同核酸染料PI进行双染，检测药物处理后细胞的早期凋亡率，结果显示IC50浓度的hainanenin-1处理细胞24h后，MCF-7细胞早期凋亡率达到62％; Hoechst33258染色结果显示，hainanenin-1能够引起染色体凝集细胞核皱缩;最后，通过检测caspase-1，3，9的活化率发现，hainanenin-1能够大量激活MCF-7细胞内caspase3和caspase9的表达，而与细胞焦亡及炎症因子释放相关的caspase-1没有明显的被活化。我们的研究确定hainanenin-1具有明显的抗癌活性，其自身结构特点及在抗癌方面表现出的极佳活性会为hainanenin-1在医药领域的开发应用奠定基础。