亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶基因克隆与生理功能分析

摘要

二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR，EC1.5.1.3)是生物体内叶酸代谢过程的关键酶，利用辅酶NADPH催化二氢叶酸(Dihydrofolate， DHF)还原生成四氢叶酸（Tetrahydrofolate，THF）。THF作为一碳单位的传递体参与到DNA和RNA的合成、氨基酸的代谢以及DNA、蛋白质和磷脂的甲基化反应中，对于生物体内细胞增殖、蛋白质的合成和甲基化反应起着极其重要的作用。因此，DHFR被广泛用作包括抗癌、抗菌、抗疟等药物筛选的靶标分子。亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis Guenée）是我国重要的农业害虫，由于其钻蛀特性，防治困难。对其二氢叶酸还原酶的表达水平和生理功能的研究，有助于明确DHFR在其生长发育过程中的作用，以达到对玉米螟进行有效防治的目的。
　　本论文以亚洲玉米螟为研究对象，首先获得其二氢叶酸还原酶的基因序列;获得了二氢叶酸还原酶基因在玉米螟不同发育时期和不同组织部位的表达模式;利用RNA干扰技术，分析了DHFR在玉米螟生长发育和生殖方面的生理功能;分析了喂食抑制剂对玉米螟生长发育的影响。本论文的工作获得了如下结果:
　　（一）亚洲玉米螟OfDHFR cDNA的调取:获得的cDNA总长度为794 bp，其中编码区:558bp，编码185个氨基酸。GeneBank登录号为:KJ803015;
　　（二）亚洲玉米螟OfDHFR基因表达模式研究:OfDHFR在亚洲玉米螟生长发育的各个时期均有表达，在玉米螟卵的初期、三龄初期、五龄末期和刚羽化的雌性成虫体内的表达水平相对较高;OfDHFR在玉米螟的脂肪体和表皮中表达水平较高，在丝腺中表达水平相对较低;
　　（三）玉米螟雌性成虫的RNA干扰实验表明:对5龄第2天的幼虫进行RNA干扰，OfDHFR表达水平和表型未见差异;对羽化后的雌性成虫进行RNA干扰，OfDHFR的表达水平下降48％，产卵数降低65％;
　　（四）DHFR抑制剂氨甲蝶呤(Methotreate，MTX)喂食实验表明:MTX抑制玉米螟生长发育:喂食MTX的浓度≥12.5ppm时，可以极显著的降低玉米螟的化蛹率和羽化率; MTX的浓度≥25ppm时，玉米螟死亡率显著提高，存活玉米螟的生长发育受到了明显抑制;MTX的浓度为50ppm和100ppm时，OfDHFR基因的表达水平分别下调23％和35％。