基于脱碱基位点凝血酶的免标记检测

摘要

DNA是染色体的主要组成成分，同时也是遗传信息的载体。然而，细胞内的DNA不断受到外界或内部因素的干扰。一个细胞每天约产生104个缺嘌呤位点和500个缺嘧啶位点，简称脱碱基位点，即AP位点。目前，对AP位点的检测蓬勃发展，并已将其应用于分析检测领域。作为一类特殊的寡核苷酸链，核酸适配体在目标分子识别中有着高灵敏度与高特异性。
　　凝血酶是一种非常重要的蛋白酶，具有促凝和抗凝双重功能，是机体凝血系统中重要的衡量指标。其在调控血栓形成、组织修复中发挥着重要作用。因此，对凝血酶快速、准确的检测在临床诊断中具有重要意义。
　　本文在与凝血酶核酸适配体链(Apt15的3'端延长6个碱基)部分互补的单链DNA中引入AP位点，设计了含AP位点的双链DNA，即AP-dsDNA。分别以银纳米簇(AgNCs)和2-氨基-6，7-二甲基-4-羟基蝶啶(diMe-pteridine)为荧光探针，基于荧光猝灭和恢复机理构建了两种免标记的凝血酶检测传感器。
　　研究发现，AP-DNA的长度对于检测体系有着重要影响，采用长度适宜的AP-DNA可以提高检测的灵敏度。同时，考察了缓冲溶液、孵育时间、温度等对检测体系的影响。在优化实验条件的基础上对凝血酶样品进行检测，得到其线性范围。以Ag NCs为荧光探针时，凝血酶线性范围:2.98×10-8～1.00×10-7 mol/L，检出限为1.69×10-8 mol/L(S/N=3)。以diMe-pteridine为荧光探针时，凝血酶线性范围:9.09×10-9～9.2×10-8 mol/L，检出限为7.06×10-9 mol/L(S/N=3)。最后，考察了体系的特异性，结果表明两种体系对凝血酶均具有较好的选择性。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 脱碱基位点概述

1．1．1 脱碱基位点的检测

1．1．2 脱碱基位点在分析领域中的应用

1．1．3 脱碱基位点的研究进展

1．2 核酸适配体

1．3 凝血酶

1．3．1 凝血酶的性质

1．3．2 凝血酶的检测方法

1．4 选题依据与研究内容

2 实验部分

2．1 实验所用DNA序列

2．2 相关溶液的配制

2．3 实验中主要仪器

2．4 实验中主要试剂

3 基于AP-dsDNA为模板合成Ag NCs及其对凝血酶的检测

3．1 Ag NCs的合成及其光谱性质

3．2 实验机理的验证

3．3 实验条件的优化

3．3．1 Ag NCs生成时间的优化

3．3．2 缓冲溶液组成的优化

3．3．3 Ag NCs与凝血酶孵育时间的优化

3．3．4 AP-DNA长度的优化

3．4 凝血酶的线性范围与检出限

3．5 特异性检测

3．6 本章小结

4 基于diMe-pteridine／AP-dsDNA对凝血酶的检测

4．1 DiMe-pteridine溶液的光谱性质

4．2 实验机理的验证

4．3 实验条件的优化

4．3．1 缓冲溶液pH值的优化

4．3．2 DiMe-pteridine与AP-dsDNA孵育时间的优化

4．3．3 DiMe-pteridine／AP-dsDNA与凝血酶孵育时间的优化

4．3．4 反应温度的优化

4．3．5 AP-DNA长度的优化

4．3．6 AP-dsDNA与diMe-pteridine浓度比值的优化

4．4 凝血酶的线性范围与检出限

4．5 特异性检测

4．6 本章小结

结论

论文创新点及展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢