从原鸽cathelicidin的发掘解析鸟类免疫功能基因的进化趋同及免疫调节

摘要

Cathelicidins是包括人类在内的脊椎动物所特有的宿主防御肽，是构成脊椎动物自然免疫的关键组分，在宿主抗感染及免疫调节方面发挥重要作用，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁，该基因的缺失或异常表达都将导致严重疾病的发生。本研究首次从鸟纲鸽形目原鸽(Columba livia)的法氏囊cDNA文库中，通过RACE-PCR克隆得到两条cathelicidins的编码基因，其开放阅读框(ORF)大小分别为471bp和450bp，均由N端信号肽区域、中间保守cathelin区域和C端成熟肽区域构成，编码的成熟肽根据结构特征分别命名为 C1-CATH2(LIQRGRFGRFLGRIRRFRPRINFDIRARGSIRLG，34aa)和C1-CATH3(RVKRFWPLVPVAINTVAAGINLYKAI KRK,29aa)。组织表达谱分析结果显示C1-CATH2和3都具有广泛的组织分布，但表达谱差异显著。C1-CATH2在脾脏、肺、法氏囊和肝脏的表达量均高于C1-CATH3，而C1-CATH3在肾脏和心脏的表达量高于前者。
　　通过单纯鸟纲及多纲物种的cathelicidins序列比对发现与由多重基因复制导致的哺乳纲cathelicidins的高度差异性不同，鸟纲cathelicidins家族中除最古老的B1家族外，其余家族序列包括成熟肽区域在内均极度保守。随后进行的系统进化树分析和同义突变率（Ks）与非同义突变率(Ka)比值Ka/Ks计算进一步证明鸟纲cathelicidins各家族与B1，CATH1/3与CATH2间呈进化阳性选择。这种选择推进鸟类cathelicidins向序列更短，活性更强的家族进化。同时证明了CATH1和CATH3家族序列存在高度的进化趋同性，揭示了CATH1和CATH3基因家族可能起源于同一个基因的多拷贝变异。
　　由于CATH2家族是鸟纲物种表达最丰富的cathelicidins家族，但其in vitro抗菌活性却弱于其他家族，我们推测它可能通过对鸟类免疫系统的调节作用间接发挥防御功能.于是我们进一步验证了C1-CATH2对免疫系统的调节作用。结果显示C1-CATH2可以从mRNA及蛋白水平均显著下调LPS激活的小鼠巨噬细胞RAW264.7中诱导型NO合酶、肿瘤坏死因子（TNF-α)，白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)等致炎细胞因子水平，但却选择性提高抗炎细胞因子白介素-10(IL-10)的表达水平。进一步我们利用圆二色谱(Circular Dichroism, CD)与Rosetta(version3.5)建模获得了C1-CATH2的高级结构，显示C1-CATH2具有高比例的α-螺旋，与其他许多正电荷两亲性的宿主防御肽家族一致，这种结构特征有利于与靶细胞结合并嵌入，最终破坏其形态结构的完整性。通过分子对接(Molecular Docking)验证，辅助免疫印迹（western blotting）实验对C1-CATH2免疫调节机理进行了研究。结果揭示了C1-CATH2通过调节TLR4受体通路，继而影响下游的MAPK通路(p38，JNK1/2，ERK1/2)磷酸化水平，并最终影响转录因子蛋白家族NF-κB的核定位来调控各炎症因子水平。同时，我们于国内外首次阐明了cathelicidin与TLR4-MD-2膜受体复合物的相互作用方式:通过结合于复合物中的MD-2口袋边缘区域，以空间位阻方式阻碍LPS进入口袋，进而干扰了LPS诱导引起的TLR4-MD-2复合物的二聚化而最终抑制了TLR4通路激活。

目录

声明

摘要

引言

1．文献综述

1．1 Cathelicidins概述

1．1．1 Cathelicidins简介

1．1．2 Cathelicidins的表达与组织分布、基因调控

1．1．3 Cathelicidins的结构与分类

1．1．4 Cathelicidins的生物学功能

1．2 鸟纲cathelicidins的研究

1．2．1 鸟纲cathelicidins的表达谱及免疫进化分析

1．2．2 鸟纲cathelicidins的生物学功能

1．3 Cathelicidins在宿主免疫信号通路中的调节作用

1．3．1 病原菌相关分子模式的免疫识别

1．3．2 Cathelicidins对Toll-样受体介导的细胞内信号通路的调节作用

1．3．3 Cathelicidins对Nod-样受体介导的细胞内信号通路的调节作用

1．3．4 Cathelicidins对其他受体介导的细胞内信号通路的调节作用

1．4 选题依据和研究内容

1．4．1 选题依据

1．4．2 研究内容

2 原鸽cathelicidins的基因克隆和序列分析

2．1 引言

2．2 仪器与试剂

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验菌株

2．2．3 实验试剂

2．2．4 实验耗材及仪器

2．2．5 实验所用试剂和培养基

2．3 实验方法

2．3．1 原鸽各组织总RNA的提取和法氏囊cDNA文库的构建

2．3．2 原鸽cathelicidins基因的克隆

2．3．3 原鸽cathelicidins的鉴定及序列比对分析

2．3．4 原鸽cathelicidins的组织表达特异性分析

2．4 实验结果

2．4．1 RNA与cDNA的检测结果

2．4．2 半巢式RACE-PCR结果和菌落PCR结果

2．4．3 测序结果分析

2．4．4 Cl-CATHs的鉴定与分析

2．4．5 Cl-CATHs的组织表达谱研究

2．5 本章小结

3 Cl-CATHs的进化分析

3．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 鸟纲cathelicidins系统进化树的构建

3．2．2 Ka／Ks计算软件对序列进行进化选择分析

3．3 实验结果分析

3．3．1 Cl-CATHs与鸟纲其他物种来源的cathelicidins的进化分析

3．3．2 鸟纲cathelicidins序列的同义突变和非同义突变分析

3．4 本章小结

4 Cl-CATHs的结构与功能研究

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 抗菌活性相关实验所用材料和仪器

4．2．2 免疫调节活性相关实验所用材料和仪器

4．3 实验方法

4．3．1 Cl-CATHs结构分析

4．3．2 Cl-CATH2的抗菌活性检测与其对微生物细胞形态的影响

4．3．3 Cl-CATH2的免疫调节活性及其机理研究

4．4 实验结果分析

4．4．1 Cl-CATHs的两亲性与结构预测分析

4．4．2 Cl-CATH2的抗菌谱分析与其对微生物细胞形态的影响

4．4．3 Cl-CATH2的免疫调节活性

4．4．4 Cl-CATH2对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌相关的信号通路的影响

4．4．5 Cl-CATH2与TLR4-MD-2受体复合物的分子相互作用机制研究

4．5 本章小结

结论

参考文献

附录

硕士期间发表学术论文和申请专利情况

致谢