用于线粒体微环境参数响应的荧光染料研究

摘要

对细胞器的研究一直是认识细胞结构和功能的重要方法，线粒体作为细胞的能量工厂，参与众多的新陈代谢过程，许多病理学过程均与它相关，一直以来都是研究的热点。虽然目前已报道许多线粒体相关的荧光染料，但是大部分只能应用于线粒体内金属离子、活性氧物种、有机小分子或酸碱环境的响应，而对于线粒体内黏度或极性响应的荧光染料未见报道，是生物学研究的薄弱领域，因此，设计合成线粒体黏度或极性响应的荧光染料对深入探索线粒体在生物过程的细节作用具有重要意义。
　　1.将苯基引入到氟硼吡咯(BODIPY)染料的3，5-位，噻唑环引入到1，7-位，8-位引入吡啶基，合成染料DPT，对中位吡啶氮原子甲基季铵化，得到最终产品M-DPT。通过测试光谱性质得知，这两例荧光染料的发射波长均处于近红外光区(λem, DPT=655nm和λem,M-DPT=718 nm)，特别是M-DPT，在吡啶季铵化后，染料的最大发射波长红移到长波长区域，斯托克斯位移增大到48 nm，荧光发射光谱不受溶剂和pH值变化的影响，通过理论计算解释了波长红移和斯托克斯位移增大的现象。同时，M-DPT具有活细胞通透性，可对线粒体进行特异性染色和成像。
　　2.通过对中位醛基取代的五甲川菁染料母体进行苄基季铵化得到染料Mito-V。该染料具有两个最大吸收（410nm和610nm）和发射峰（456 nm和665 nm），随着溶液黏度增加，两个荧光发射强度增加幅度不一致，且长波长与短波长处荧光比率的对数值，或长波长处荧光寿命的对数值，均与黏度对数值之间成良好的线性关系(R2=0.992和0.998)。Mito-V具有活细胞通透性，可通过比率荧光和荧光寿命成像两种方法监测线粒体黏度变化。
　　3.将香豆素和苄基季铵化后的苯并噻唑基团通过共轭连接得到染料BOB。该染料具有两个吸收最大吸收（426nm和561nm）和发射峰（467nm和645 nm），随着溶液极性增加，短波长与长波长处荧光强度的比值，与溶液极性值呈良好的线性关系(R2=0.93)，可通过比率荧光测试溶液极性。BOB具有活细胞通透性，可对活细胞中线粒体特异性染色，是一例能够用来观察线粒体极性变化的示踪剂。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要符号表

1 绪论

1．1 经典荧光染料

1．1．1 菁类染料

1．1．2 氟硼吡咯类荧光染料

1．1．3 香豆素类荧光染料

1．1．4 罗丹明类染料

1．1．5 其他荧光染料

1．2 细胞器的作用及常用荧光染料

1．2．1 细胞核及常用荧光染料

1．2．2 线粒体及常用荧光染料

1．2．3 溶酶体及常用荧光染料

1．2．4 内质网及常用荧光染料

1．2．5 高尔基体及常用荧光染料

1．3 线粒体荧光染料研究进展

1．3．1 线粒体成像类荧光染料

1．3．2 响应线粒体内离子的荧光染料

1．3．3 响应线粒体内活性氧类荧光染料

1．3．4 响应线粒体内有机小分子类荧光染料

1．3．5 应用于线粒体内酸碱环境类的荧光染料

1．4 论文选题及设计思想

2 示踪线粒体形态变化的近红外荧光染料

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 中间体及目标物的合成

2．2．3 荧光量子产率的测定

2．2．5 pH干扰实验

2．2．6 极性干扰试验

2．2．7 光稳定性实验

2．2．8 细胞孵育实验

2．2．9 CCCP膜电位干扰实验

2．2．10 染料M-DPT细胞毒性实验

2．2．11 理论计算

2．3 结果与讨论

2．3．1 染料的合成

2．3．2 DPT与M-DPT的吸收和荧光发射光谱

2．3．3 中位吡啶季铵盐引起的光谱红移现象的理论解释

2．3．4 染料M-DPT光物理性质

2．3．5 细胞成像

2．3．6 M-DPT的细胞毒性测试

2．3．7 膜电位干扰实验

2．3．8 染料M-DPT用于成像受损程度不同的线粒体

2．4 本章小结

3 双模式监测线粒体黏度的荧光染料

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器与试剂

3．2．2 中间体及目标物的合成

3．2．3 染料在不同黏度内荧光光谱和荧光寿命的测试

3．2．4 双光子吸收有效截面测试

3．2．5 染料基本光谱性质测定

3．2．6 细胞孵育实验

3．2．7 理论计算

3．3 结果与讨论

3．3．1 染料的合成

3．3．2 染料的光物理性质

3．3．3 Mito-V对溶液黏度值的响应

3．3．4 理论解释荧光双发射及对黏度响应

3．3．5 染料与生物大分子的相互作用

3．3．6 双光子吸收性质

3．3．7 双模式细胞成像

3．3．8 Mito-V的细胞毒性测试

3．3．9 膜电位干扰实验

3．3．10 Mito-V双模式监测细胞凋亡过程中线粒体黏度变化

3．4 本章小结

4 用于线粒体极性的比率型荧光染料

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 仪器与试剂

4．2．2 中间体及目标物的合成

4．2．3 染料基本光谱性质测定

4．2．4 细胞孵育实验

4．2．5 理论计算

4．3 结果与讨论

4．3．1 染料的设计思想

4．3．2 染料的光物理性质

4．3．3 BOB对溶液极性的响应

4．3．4 细胞成像实验

4．3．5 染料的光物理性质

4．3．6 BOB的细胞毒性测试

4．3．7 膜电位干扰实验

4．3．8 染料BOB在凋亡细胞中的应用

4．3．9 癌细胞内线粒体极性降低

4．4 本章小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢

作者简介