金黄色葡萄球菌血浆凝固酶抗血清制备及ELISA检测

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在微生物分类学上属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表，也是人类的一种重要病原微生物。金黄色葡萄球菌检验是药品、保健品、化妆品、食品的重要检验项目。金黄色葡萄球菌检验，分为法定检验和快速筛选。法定检验常用标准都需以兔血浆进行血浆凝固酶试验确证结果，由于兔血浆质量稳定性和可控性较差，检验人员的视觉误差，血浆凝固酶实验常会发生假阴性和假阳性;开发ELISA检测方法能提高血浆凝固酶实验的灵敏度和特异性，ELISA检测方法也可直接用于金黄色葡萄球菌快速筛选。
　　论文研究以灭活的金黄色葡萄球菌为抗原免疫新西兰大白兔，获得了效价为1∶4000的血浆凝固酶兔抗血清;同时免疫豚鼠，获得了效价为1∶2000的血浆凝固酶豚鼠抗血清。以两种抗血清建立双抗体夹心ELISA方法，优化后ELISA实验条件为:豚鼠抗血清作为包被抗体，兔抗血清作为检测抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为酶标抗抗体，兔抗血清按1∶2000稀释，豚鼠抗血清按1∶1000稀释，酶标记的羊抗兔抗体按1∶5000稀释。ELISA检测方法的评价结果是:枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、沙门氏菌、白色念珠菌、黑曲霉用ELISA法检测，均无显著交叉反应，特异性良好;ELISA检测多个样品组内变异系数在7.4％～12.4％，组间变异系数在8.5％～14.2％，变异程度较小，重复性好;ELISA法用于血浆凝固酶检测灵敏度高于兔血浆凝固法;ELISA法用于金黄色葡萄球菌快速检测灵敏度高于国标法，低于实时荧光定量PCR法。证明建立的血浆凝固酶双抗体夹心ELISA方法在灵敏度、特异性及重复性方面均能满足检验需求。国标法检测金黄色葡萄球菌至少需要72小时，ELISA法检测金黄色葡萄球菌只需12小时，ELISA法检测速度能满足快速筛选的需求。ELISA法检测每个样品的费用不超过现有方法的十分之一，在检验成本方面较有较大的优势。ELISA法能为基层检验机构进行金黄色葡萄球菌快速检验提供良好的技术保障。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 金黄色葡萄球菌及其检验方法

1．2 血浆凝固酶及其检验方法

1．3 酶联免疫分析(Ensyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

1．3．1 ELISA的原理与分类

1．3．2 ELISA检测方法的使用材料

1．4 论文研究的目的及意义

1．5 论文研究的内容

2 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶抗血清的制备

引言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 抗原佐剂制备

2．2．2 新西兰白兔免疫

2．2．3 豚鼠免疫

2．2．4 免疫双向扩散实验测定抗血清的效价

2．2．5 实验动物全血采集

2．3 实验结果

2．3．1 新西兰白兔抗体产生

2．3．1 豚鼠抗体产生

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 金黄色葡萄球菌双抗体夹心ELISA方法的建立

引言

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 阳性样本和阴性对照样本的制备

3．2．2 兔抗血清的ELISA效价测定

3．2．3 豚鼠抗血清的ELISA效价测定

3．2．4 抗原抗体最佳孵育时间的选择

3．2．5 封闭物的选择

3．2．6 封闭时间的选择

3．2．7 检测抗体和包被抗体的选择

3．2．8 包被抗体和检测抗体工作浓度组合的选择

3．2．9 酶标抗体工作浓度的选择

3．2．10 酶标抗体催化反应底物作用时间的选择

3．3 实验结果

3．3．1 抗血清效价

3．3．2 抗原抗体孵育时间

3．3．3 封闭剂

3．3．4 封闭时间

3．3．5 包被抗体和检测抗体

3．3．6 包被抗体和检测抗体的使用浓度

3．3．7 酶标抗体浓度

3．3．8 催化底物反应时间

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 金黄色葡萄球菌双抗体夹心ELISA法方法学评价

引言

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法特异性评价

4．2．2 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法重复性评价

4．2．3 双抗体夹心ELISA法与兔血浆凝法检测血浆凝固酶实验比对

4．2．4 国标检测方法与血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法和实时荧光定量PCR检测比较

4．3 实验结果

4．3．1 血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法特异性评价

4．3．2 血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法重复性评价

4．3．3 血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法与兔血浆凝法检测血浆凝固酶实验比较

4．3．4 国标检测方法与血浆凝固酶双抗体夹心ELISA法和实时荧光定量PCR法比较

4．4 本章小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢