疏水电荷诱导介质的制备及在抗体分离的应用

摘要

抗体类药物是目前生物技术类药物中最重要的一类，因其专一性强、亲和力高，在医药和研究领域具有广泛的应用前景。这类药物在生物医药市场的规模已经超过20%，且呈逐年增加的趋势。随着市场需求和生产规模的不断扩大，如何从复杂的料液中快速、高效的分离纯化抗体，以提高抗体类产品生产过程的经济性是目前生物工程领域的一个重要研究方向。本论文针对抗体的色谱分离过程，提出了一种基于三唑基团的新型疏水电荷诱导吸附剂的制备方法。该方法利用三唑及衍生物对抗体分子的选择性吸附作用，实现抗体在生理条件下与配基结合；并在弱酸条件下利用静电排斥作用实现抗体的洗脱，从而克服了上样条件复杂，洗脱条件苛刻等问题。本论文的研究内容包括以下几个方面：
　　（1）研究了以琼脂糖凝胶为基质，利用点击化学固载三唑衍生物基团，考查其对三种模式蛋白的吸附行为。研究发现三唑衍生物在蛋白吸附过程中具有pH依赖性，且吸附容量受盐浓度的影响较小，这些特征符合疏水电荷诱导层析的典型特征。人抗体IgG在中性pH条件下吸附容量最高，达到15 mg/mL gel，此条件下对其他蛋白的吸附量较低。上述结果表明，三唑及其衍生物有作为疏水电荷诱导层析吸附剂的潜力，需进一步的考查高配基密度下的抗体载量及选择性。
　　（2）为提高抗体载量，以亲水性聚苯乙烯微球为载体，结合原子转移自由基聚合（Atom transfer radical polymerization, ATRP）技术和铜催化的点击反应(Cu-catalyzed click reaction)，成功地制备了高密度三唑基疏水电荷诱导层析吸附剂。考查了溶液条件和材料性质对抗体吸附的影响，静态饱和吸附容量（Qm）达到240 mg/g，动态吸附容量高达88 mg/g；以柠檬酸缓冲液（0.01 mol/L, pH3.0）为洗脱剂，洗脱效率超过80%，重复使用后吸附容量未发生明显下降。通过SDS-PAGE分析，三唑基疏水电荷诱导层析吸附剂在分离复杂溶液中的抗体时具有较高的选择性，pH4.0的柠檬酸洗脱液液洗脱，IgG的纯度达到95%以上。
　　（3）针对原子转移自由基聚合反应过程复杂，铜离子较难去除等实际问题，本文又筛选了新的三唑衍生物：5-羧基苯并三唑，实现了疏水电荷诱导层析凝胶介质的简易制备。在生理条件下，苯并三唑吸附剂对IgG的动态结合容量高达57.7 mg/mL gel，较传统的疏水作用色谱提高60%以上；以人血浆中抗体为分离目标，利用pH4.0的柠檬酸缓冲液一步洗脱，纯度超过95%，收率超过70%，且降低洗脱缓冲液pH，有利于提高抗体回收率。此外，苯并三唑吸附剂对牛和马血清中抗体具有较好的分离效果，当胶血比为1:1时，抗体纯度都超过80%，回收率达到80%以上。
　　本论文的研究成果表明，基于三唑基团的疏水电荷诱导层析基质能够高效的实现人血浆及多种动物血清中分离抗体组分，为疏水电荷诱导层析的配基的设计与筛选提供新的方向。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 抗体

1.2 抗体的生产工艺

1.3 抗体的色谱分离

1.4 疏水电荷诱导色谱

1.5 本论文研究目的及意义

2 三唑衍生物的蛋白吸附特性

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 高载量疏水电荷诱导层析介质的制备及评价

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 苯并三唑吸附剂的制备及评价

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.5 本章小结

结论

展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢