磷酸化修饰诱导的Bcl-2蛋白的构象改变及其动力学

摘要

Bcl-2蛋白是肿瘤靶标蛋白。其BH结构域早己被结构生物学家解析获得，但其loop区(residues 34-92)的结构尚未被解析出来。值得注意的是，Bcl-2蛋白能够在loop区上的Thr69、Ser70、Ser87发生单位点或多位点的磷酸化修饰。最近研究表明高表达磷酸化Bcl-2蛋白的细胞系对FDA批准上市的Bcl-2抑制剂类抗癌药ABT-199及其衍生物耐药。这些研究结果都表明loop区虽然在空间上远离BH结构域，但是它的结构改变可以调控Bcl-2蛋白的功能。但是，Bcl-2的磷酸化修饰是否影响了结构域，并因此导致功能改变，至今仍不清楚。对含有loop区的Bcl-2分子结构进行解析将解决这一问题，例如发现磷酸化修饰如何调控Bcl-2与配体之间的相互作用，以及如何导致现有的抗癌药对磷酸化Bcl-2(pBcl-2)产生耐药性的机制，进而帮助我们设计靶向pBcl-2的抑制剂。 目前，NMR或X-Ray晶体衍射等方法都无法对含有loop区的Bcl-2蛋白进行结构解析。计算机分子模拟技术30多年以来已经成为指导和辅助实验的有效手段。通过计算的方法同源模建了Bcl-2分子，并对其进行了全原子分子动力学模拟(MolecularDynamic Simulation，MD)。通过六组200ns的长时间模拟，发现Bcl-2在磷酸化后其BH3沟槽发生了构象改变。BH3沟槽是Bcl-2家族所有成员共有的结构域，也是家族成员之间相互作用的界面，介导细胞的生存和凋亡的发生。进一步，通过MD模拟的主成分分析，发现loop区磷酸化位点的与BH3沟槽的运动是紧密相关的。MD模拟发现磷酸化促使Bcl-2的α2末端及α3的位置发生了较大幅度的构象变化。通过MM-GBSA方法对Bcl-2及pBcl-2与配体的结合自由能分析，发现BH3沟槽构象的改变直接影响到了Bcl-2与配体的亲和力，例如Bcl-2蛋白磷酸化后与Bax BH3的结合自由能增强，与Bim BH3及ABT-199之间的结合自由能减弱。这些结果在生物学实验中被验证。结合自由能残基分解识别出了BH3沟槽界面与各配体结合时的关键氨基酸残基。进一步对比Bcl-2及pBcl-2复合物中这些关键残基对结合能贡献的变化情况，识别出了磷酸化调控Bcl-2抗凋亡功能的关键的BH3沟槽界面残基。本论文从分子和原子水平上解析了无结构的loop区的磷酸化修饰对Bcl-2蛋白的结构域的构象调控。

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