改造酿酒酵母内源基因表达提高木糖利用和乙酸胁迫耐受性

摘要

木糖是木质纤维素原料水解液中最主要的五碳糖成分，其利用有助于提高木质纤维素生物转化效率，然而广泛用于多种生物燃料和生物基化学品生产的酿酒酵母缺乏有效的木糖利用途径，必须通过代谢工程改造才能利用木糖。虽然已对木糖利用重组酵母的构建进行了多年的研究探索，但木糖发酵能力差的问题仍然比较突出。此外，木质纤维素原料预处理过程中产生多种抑制酿酒酵母生长和发酵的物质，其中乙酸是主要抑制物成分，且酵母在木糖发酵时对乙酸的敏感性比在葡萄糖条件下更高。因而，提高酿酒酵母菌株的木糖代谢能力和乙酸胁迫耐受性是选育高效发酵菌株的关键。
　　近期研究表明，酿酒酵母中涉及转录调控、线粒体功能相关以及MAPK信号通路等的多个内源关键基因的突变或表达水平变化对木糖利用具有重要影响，但内源基因对酿酒酵母木糖利用的影响机理还不清楚。因此，对影响木糖利用的关键内源基因进行深入探索，有利于揭示酿酒酵母木糖利用的全局调节机制，提高菌株选育效率。
　　首先，本研究比较了多个酿酒酵母菌株，包括实验室酵母、工业酵母和自然界分离的野生酵母菌株等的混合糖发酵能力和环境胁迫耐受性。发现一株分离自甘蔗渣中的野生酿酒酵母菌株YB-2625具有较好的混合糖利用能力，在80g/l葡萄糖和20g/l木糖的培养基中发酵96h时消耗15.2g/l木糖，而实验室模式酵母S288c仅可消耗7.6g/l木糖，因此推测野生酵母菌株可通过长期自然选择调整其碳源利用相关的代谢调控网络。其次，利用转录组测序(RNA-Seq)比较了YB-2625和模式酵母S288c在混合糖利用过程中全局基因转录的差异。对混合糖发酵阶段和纯木糖利用阶段分别进行比较转录组分析，发现与实验室酵母S288c相比，野生酵母YB-2625的内源木糖代谢基因(XYL2和XKS1)，糖异生以及TCA循环相关基因有更高的表达水平，可能有利于菌株的木糖利用。此外，野生酵母YB-2625胞内与葡萄糖抑制相关的转录调控因子编码基因，包括MIG1、MIG2、MIG3和HXK2转录水平明显下调，推测该菌株可通过缓解葡萄糖抑制作用促进木糖的利用。此外，YB-2625菌株在混合糖发酵过程中，与抗氧化酶相关的基因（CTT1、CAT1、SOD2和PRX1）转录水平更高，与之对应的是在木糖发酵阶段YB-2625过氧化氢酶(CAT)酶活水平为S288c的1.9倍，此外，在混合糖和纯木糖发酵这两个阶段，其胞内ROS水平分别比对照低43.3％和58.6％，推测氧化胁迫耐性的提高有助于木糖利用。进一步实验证明，过表达抗氧化酶基因CTT1和PRX1可增加菌株以木糖为唯一碳源的生长能力，过表达菌株的木糖消耗分别增加了13.5％和18.1％。
　　除了转录水平，基因组序列突变分析也可提供影响木糖利用和胁迫耐受性的相关基因信息。因此进一步对YB-2625基因组进行了测序，并分析与木糖利用和环境胁迫耐性相关的功能基因。YB-2625基因组全长11.84Mb，与模式酵母S288c相比较，存在多个YB-2625特异性的基因以及与碳代谢和环境胁迫相关功能基因的突变。其中组蛋白乙酰化酶编码基因RTT109在YB-2625菌株中存在错义突变位点，在转录组分析中该基因表达也下调，因此对该基因的功能进行了深入研究。在实验室菌株BY4741中敲除RTT109基因后提高了菌株的乙酸耐受性，在添加了5.5g/l乙酸的抑制条件下进行100g/l葡萄糖发酵，RTT109敲除突变株延滞期由对照菌株的60h缩短至12h，乙醇生产强度由对照菌株的0.39提高至0.60g/l/h。敲除突变体中胁迫响应相关的基因，如CTT1、GSH1、SOD1和GPX1等转录水平均有所提高。在乙酸胁迫条件下发酵至稳定期时RTT109敲除突变体胞内的总SOD酶活力为115.45U/mg蛋白，而对照菌株酶活仅为79.63U/mg蛋白，同时RTT109敲除突变体GSH-Px活力也比对照菌株高77.1％。但在YB-2625中敲除RTT109未观察到环境胁迫耐性的差别，推测该基因的作用可能具有宿主遗传背景依赖性。
　　利用YB-2625作为宿主菌株构建木糖利用重组酿酒酵母，初始构建的菌株YB-2625CCX木糖利用率低且副产物木糖醇产率高，因此在rDNA位点进行木糖醇脱氢酶(XDH)基因多拷贝整合过表达，通过筛选得到的YB-73菌株在混合糖发酵过程中木糖醇产率降低了64.6％，乙醇产量提高了13.9％。对基因组测序和比较转录组数据进行深入分析，发现染色体重构复合体亚基编码基因NGG1具有点突变，且在木糖利用阶段基因转录明显下调。敲除NGG1可明显增强木糖重组菌株在5mM H2O2氧化胁迫条件下的生长，更为重要的是，NGG1敲除可提高重组菌株的木糖发酵能力，在40g/l纯木糖中发酵96h后，木糖残糖量为4.9g/l,对照菌株的残糖量为12.7g/l。同时，NGG1敲除突变体的乙醇产量相比于对照菌株提高了84.6％。进一步对NGG1敲除菌株木糖利用提高的分子机理进行初步探索，发现NGG1敲除可提高木糖脱氢酶基因XYL1的表达，同时可提高氧化胁迫相关基因SOD1和CTT1的表达水平，推测NGG1可通过调控碳代谢关键基因表达与酵母细胞的胁迫耐受性基因表达提高木糖利用。
　　本文的研究为进一步深入探讨酿酒酵母内源基因表达调控和宿主遗传背景影响木糖利用的机理，开发新的代谢工程改造靶点，选育木糖代谢和乙酸耐受性提高的重组菌株，进而提高木质纤维素原料的生物转化效率提供了基础。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

缩写词表

1绪论

1．1纤维素乙醇生产过程中的瓶颈问题

1．1．1纤维素乙醇生产过程概览

1．1．2五碳糖-木糖的代谢

1．1．3乙酸毒性

1．2酿酒酵母木糖代谢途径的改造

1．2．1 XR-XDH和XI途径

1．2．2木糖代谢新途径开发

1．2．3磷酸戊糖途径

1．2．4酿酒酵母木糖的转运

1．2．5菌株进化工程改造

1．3酿酒酵母菌株乙酸耐受性提高策略

1．3．1絮凝性对酵母乙酸耐受性的影响

1．3．2金属离子添加提高乙酸耐受性

1．4酵母菌株多样性和基因多样性研究

1．4．1宿主选择对菌株构建的影响

1．4．2木糖利用及胁迫耐受性的调控机理探究

1．5全局转录调控对纤维素乙醇生产菌株构建的影响

1．5．1 转录调控对酿酒酵母菌株木糖代谢的影响

1．5．2内源基因突变对酵母菌株木糖代谢的影响

1．5．3 组蛋白修饰和染色体重构对碳源代谢和胁迫耐受性的影响

1．5．4转录调控对酵母菌株抑制物胁迫耐受性的影响

1．6纤维素乙醇生产菌株构建的技术手段

1．7本论文的研究思路与研究意义

2野生酿酒酵母内源抗氧化酶基因对木糖代谢的影响

2．1引言

2．2实验材料与方法

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2主要仪器和试剂

2．2．3菌株性能评价方法

2．2．4比较转录组分析样品采集及菌株纯木糖发酵评价

2．2．5比较转录组和实时定量PCR(RT-qPCR)分析

2．2．6活性氧(ROS)检测

2．2．7 CAT活性检测

2．2．8氧化胁迫耐受性检测

2．2．9质粒和菌株构建

2．2．10总麦角固醇含量测定

2．2．11 HPLC分析

2．2．12统计分析

2．3实验结果与讨论

2．3．1不同酵母菌株生长和胁迫耐受性比较

2．3．2酿酒酵母菌株YB-2625和S288c木糖利用比较

2．3．3比较转录组数据概览

2．3．4 GO分析

2．3．5调控差异表达基因的转录调控因子的富集分析

2．3．6碳源代谢相关差异表达基因

2．3．7胁迫响应相关基因的差异性表达

2．3．8木糖醇毒性检测

2．3．9麦角固醇与磷脂代谢相关基因

2．3．10热激蛋白家族差异性表达

2．3．11野生酿酒酵母YB-2625天然木糖代谢及高胁迫耐性机制

2．4本章小结

3 YB-2625全基因组测序及乙酸耐性相关基因RTT109研究

3．1引言

3．2实验材料与方法

3．2．4 YB-2625全基因组测序及组装分析

3．2．5菌株胁迫耐性检测及发酵培养

3．2．6分析方法

3．2．7细胞絮凝性检测

3．3实验结果与讨论

3．3．1基因组测序数据可靠性验证

3．3．2全基因组组装分析

3．3．3特异性基因分析

3．3．4菌株进化树分析

3．3．5 YB-2625相比于S288c的SNPs

3．3．6 RTT109敲除对酿酒酵母BY4741耐受性影响

3．3．7 RTT109敲除对酿酒酵母BY4741在乙酸胁迫条件下的发酵影响

3．3．8 RTT109敲除对乙酸胁迫条件下关键基因转录的影响

3．3．9抗氧化酶和抗氧化因子检测

3．3．10 RTT109敲除对菌株絮凝性的影响

3．3．11 RTT109敲除对酵母菌株碳源利用的影响

3．3．12 RTT109敲除提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性机理探究

3．4本章小结

4重组木糖菌株构建及内源基因NGG1对木糖利用的影响

4．1引言

4．2实验材料与方法

4．2．1酵母化学转化方法

4．2．2 XDH过表达载体pUGR-XYL2构建

4．2．3转化子发酵评价

4．2．4蛋白提取及XDH酶活检测

4．2．5木糖重组菌株发酵性能评价

4．2．6 YRH396单倍体孢子生成

4．2．7 YRH396单倍体孢子生长能力评价

4．2．8基因敲除突变体构建及评价

4．2．9胞内总RNA的提取及实时定量PCR分析

4．2．10 NGG1敲除及mXDH过表达

4．3实验结果及讨论

4．3．1 rDNA多拷贝整合表达载体构建

4．3．2 XDH过表达酵母菌株的构建

4．3．3木糖重组菌摇瓶发酵性能评价

4．3．4 YB-73菌株絮凝性检测

4．3．5木糖重组菌株发酵性能比较

4．3．6 YRH396单倍体孢子验证及生长能力评价

4．3．7基因敲除突变体构建

4．3．8基因敲除突变体性能检测

4．3．9 NGG1敲除对木糖重组菌株发酵性能的影响

4．3．10 NGG1敲除与mXDH过表达对YRH396h木糖发酵的影响

4．3．11 NGG1敲除突变体关键基因表达水平变化

4．4本章小结

5结论与展望

5．1主要结论

5．2创新点

5．3展望

参考文献

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢