番茄叶斑病病原菌的鉴定及其致病机制研究

摘要

番茄病害是目前导致番茄产量严重下降的主要原因，并给番茄产业带来巨大的经济损失。2013-2014年，本课题组调查番茄病害时，在我国大连地区商业温室种植番茄基地发现一种病原菌侵染番茄植株引起番茄叶斑病。该病害具有侵染速度快和死亡率高的特点，严重影响该地区番茄的产量和质量。对引起番茄叶斑病的病原菌进行分离和鉴定，并对该病原菌侵染番茄植株的入侵途径和致病分子调控机制的研究是控制该病害的重要前提。因此，本论文围绕以上科学问题开展研究，主要研究结果和结论如下:
　　(1)发现层出镰孢菌可侵染番茄植株引起番茄叶斑病。在大连地区采集番茄叶斑病病叶，对病原菌分离纯化，科赫氏法则验证，并通过形态学、细胞学和分子生物学等方法对病原菌进行鉴定。表明层出镰孢菌是引起番茄叶斑病的新病原菌，其分类地位为真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreomycetidae)，丛赤壳科(Nectriaceae)，镰孢菌属(Fusarium)，藤仓赤霉菌交配群D(Gibberella fujikuroi D)，层出镰孢菌(Fusariumproliferatum(matsush.)Nirenberg)，命名该菌株为层出镰孢菌K140108。
　　(2)层出镰孢菌K140108是通过气孔入侵番茄叶片组织。采用扫描电镜对层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作的不同阶段进行观察。结果表明，层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作12小时，叶片表皮细胞发生不规则褶皱;互作48小时，观察到分生孢子进入叶片气孔;互作72小时，大多数气孔填满分生孢子;互作96小时，分生孢子布满叶片组织，有菌丝从气孔中长出，叶片上出现褐色水渍斑点。
　　(3)层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作转录组分析。利用RNA-seq技术对层出镰孢菌K140108侵染96小时的番茄病叶进行转录组测序分析，并以菌株K140108作为对照组。共获得61，544，598个clean reads用于de novo组装层出镰孢菌K140108参考转录组。基因功能注释分析后，得到75，044个Unigenes，其中19.46％ Unigenes被分配到276个KEGG代谢通路，其中22.30％的Unigenes与水稻恶苗病菌（Fusarium fujikuroi）具有同源性。共鉴定出18，075个表达差异基因，通过生物信息学软件预测到720个外泌蛋白并从中筛选出184个候选效应分子，其中79.89％候选效应分子在互作96小时呈上调表达。
　　(4)对互作96小时显著上调表达的五个效应分子进行功能研究，结果表明，它们与层出镰孢菌K140108的致病性不相关。对层出镰孢菌K140108原生质体的制备条件进行优化后，采用Split-PCR方法分别对五个效应分子(DN263、DN7752、DN12525、DN20100和DN18029)进行基因敲除。结果表明，与野生型相比，△dn7752和△dn12525突变体的菌丝紧贴培养基表面生长，△dn7752突变体产生明显的紫色色素，△dn263、△dn20100和△dn18029突变体的表型均无明显变化。番茄叶片侵染试验证明，五个突变体对菌株的致病力无明显影响。
　　(5)层出镰孢菌K140108丝裂原活化蛋白激酶基因FpPMK1对该菌的菌丝生长和致病性具有显著调控作用。以禾谷镰孢菌直系同源的MAKR基因GPMK1编码的蛋白为靶序列，在转录组表达差异基因中获得与其相似度为99％的同源基因DN56288，将其命名为FpPMK1。敲除基因FpPMK1，获得的△Fppmk1突变体与野生型相比气生菌丝变短，生长速率和分生孢子产量明显降低。番茄叶片侵染试验证明，△Fppmk1突变体致病性显著降低。回复试验表明，FpPMK1基因回补菌株在菌落形态、生长速率、产孢量和致病力等方面都恢复到野生型状态。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要缩写表

1 绪论

1．1番茄病害

1．1．1番茄病害的发生

1．1．2番茄病害主要症状

1．1．3番茄病害侵染方式和传播途径

1．1．4病原真菌引起的番茄病害

1．1．5番茄病害的防治方法

1．2病原真菌的分离鉴定

1．2．1 基本分离及鉴定方法

1．2．2致病性测定

1．2．3分子生物学鉴定

1．3镰孢菌研究概况

1．3．1镰孢菌的危害

1．3．2镰孢菌属分类鉴定

1．3．3镰孢菌引起的番茄病害

1．4镰孢菌致病机制的研究

1．4．1病原真菌与植物互作的分子机制

1．4．2效应分子研究概况

1．4．3镰孢菌效应分子

1．4．4 MAPK概念和特征

1．4．5镰孢菌中MAPK基因Pmk1研究概况

1．5层出镰孢菌

1．5．1 层出镰孢菌的危害

1．5．2层出镰孢菌生物学特征

1．5．3层出镰孢菌引起的病害

1．5．4层出镰孢菌致病机理的研究

1．6本论文的选题依据、研究目的和内容

1．6．1选题依据

1．6．2研究内容

1．6．3技术路线

2 引起番茄叶斑病病原菌的分离与鉴定

2．1引言

2．2材料、试剂和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3实验试剂

2．2．4试剂配制

2．2．5培养基配制

2．3实验方法

2．3．1病原菌分离

2．3．2病原菌致病性测定

2．3．3 病原菌形态学鉴定

2．3．4病原菌分子生物学鉴定

2．4实验结果

2．4．1番茄病害的症状描述

2．4．2病原菌的分离

2．4．3病原菌致病性测定结果

2．4．4病原菌形状学特征描述

2．4．5病原菌分子生物学鉴定结果

2．4．6病原菌鉴定结果

2．5讨论

2．6本章小结

3 层出镰孢茵K140108与番茄互作转录组分析

3．1引言

3．2材料、试剂与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2主要实验仪器

3．2．3实验试剂

3．3实验方法

3．3．1生物材料和接种试验

3．3．2扫描电镜样品的制备和观察

3．3．3 RNA提取

3．3．4 RNA-seq测序

3．3．5生物信息分析流程

3．3．6定量PCR验证基因表达数据

3．3．7基因表达数据分析

3．3．8序列提交

3．4实验结果

3．4．1菌株K140108与番茄互作不同时期的描述

3．4．2 RNA-seq测序数据质量

3．4．3层出镰孢菌K140108参考转录组的组装结果

3．4．4基因功能注释

3．4．5基因表达数据的验证

3．4．6差异表达基因分析

3．5讨论

3．6本章小结

4层出镰孢菌K140108中候选效应分子的筛选和功能研究

4．1引言

4．2材料、试剂与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2主要实验仪器

4．2．3 实验试剂

4．2．4试剂配制

4．2．5培养基配制

4．3实验方法

4．3．1分泌蛋白的预测

4．3．2候选效应分子筛选

4．3．7层出镰孢菌K140108原生质体制备条件的优化

4．3．8敲除基因同源重组序列的获得

4．3．9基因敲除突变体的获得

4．3．10基因回补实验

4．3．11 突变体和回补菌株表型测定

4．3．12致病性测定

4．4实验结果

4．4．1候选效应分子筛选结果

4．4．2 与参考基因组的比对结果

4．4．3候选效应基因不同侵染时间点的表达模式分析

4．4．4层出镰孢菌K140108原生质体制备方法的研究

4．4．5候选效应基因敲除和功能回复验证

4．4．6菌落形态、生长速率以及产孢量的观察和测定

4．4．7孢子萌发及菌丝形态的观察

4．4．8突变体对过氧化氢敏感

4．4．9致病性分析

4．5讨论

4．6本章小结

5层出镰孢菌K140108丝裂原活化蛋白激酶基因FpPMK1的鉴定和功能研究

5．1引言

5．2材料、试剂与仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2主要实验仪器

5．3．5FpPMK1基因敲除突变体的获得

5．3．7突变体和回补菌株表型测定

5．4．2 FpPMK1基因敲除和功能回复验证

5．4．3 菌落形态、生长速率以及产孢量的观察和测定

5．4．4孢子萌发及菌丝形态的观察

5．4．5突变体对过氧化氢敏感

5．4．6致病性分析

5．5讨论

5．6本章小结

6结论与展望

6．1结论

6．2创新点

6．3展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢