CHES1通过调节ERα活性影响乳腺癌增殖的分子机制

摘要

乳腺癌一直是威胁女性健康的一大因素。在我国，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，并且越来越趋于年轻化。因此，阐明乳腺癌发生和发展过程中的分子机制，鉴定出一系列有价值的临床标志物，将有助于乳腺癌的临床诊断和药物治疗。乳腺癌的诱发因素有很多，其中雌激素暴露被证实同乳腺癌细胞的恶性增殖和侵袭转移存在直接的联系。雌激素受体α（Estrogen Receptorα，ERα）是细胞内响应雌激素刺激并且介导信号转导的关键因子，同时ERα也是临床上重要的药物靶点。然而，参与并调节雌激素-ERα通路的分子和信号非常复杂，并且随细胞内环境的差异呈现动态变化过程。因此，阐明雌激素信号通路和ERα功能的调节网络，一直是国内外研究的热点。检查点抑制因子1(Checkpoint Suppressor1，CHES1)最早在酿酒酵母中被发现参与DNA损伤应答和细胞周期阻滞，因其包含有保守的叉头盒(Forkhead box，FOX)DNA结合结构域，也叫FOXN3。之后的研究发现，CHES1可以参与蛋白质合成、葡萄糖代谢和胚胎发育等过程，并且被证实可以作为转录抑制因子参与转录调节过程。越来越多的研究表明CHES1同多种类型癌症的发生、发展和预后存在密切的联系。数据库分析表明CHES1可能发挥肿瘤抑制作用，并且其在乳腺癌中处于低表达状态。因此，本研究从蛋白分子间相互作用入手，在分子水平探究CHES1同雌激素信号通路之间的相关性和调控机理，以及对乳腺癌细胞增殖和成瘤作用的影响。本研究的主要内容如下: (1)免疫共沉淀、免疫荧光以及GST-pulldown等实验结果证明在乳腺癌细胞中，CHES1同ERα存在直接的相互作用，并且进一步鉴定出两者相互作用所依赖的结构域。 (2)荧光素酶报告基因检测和反转录PCR等结果显示，CHES1可以作为ERα的转录辅抑制因子抑制ERα雌激素依赖的转录活性，并且可以抑制ERα下游靶基因CCND1、c-Myc以及pS2的mRNA和蛋白表达。 (3)进一步的实验探究了CHES1抑制ERα转录活性的分子机制。蛋白免疫印迹以及免疫共沉淀等实验发现CHES1并不影响ERα的蛋白稳定性、二聚化以及亚细胞定位，并且不会影响ERα同组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)HDAC1和HDAC2的相互作用;深入研究发现CHES1可以通过招募去乙酰化酶SIRT1促进ERα的去乙酰化过程，进而抑制ERα在下游靶基因启动子上的富集和转录激活。 (4)蛋白免疫印迹和免疫组化结果证实CHES1在ERα阳性的乳腺癌细胞中处于低表达状态，在ERα阴性的乳腺癌中处于高表达状态。进一步探究发现，在CHES1启动子区域存在一个保守的雌激素结合元件（Estrogen response element,ERE），染色质免疫共沉淀和实时定量PCR数据显示，ERα可以响应雌激素的刺激识别ERE基序并结合到CHES1启动子上抑制其转录表达。利用数据库分析对上述结果进行了进一步验证，发现在乳腺癌中CHES1同ERα表达水平呈负相关。 (5)通过细胞增殖和流式细胞实验证实CHES1在体外特异性抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖和细胞周期进程，通过构建小鼠模型证实CHES1在体内显著抑制ERα阳性的乳腺癌细胞的成瘤能力。生物信息学分析表明CHES1的表达同乳腺癌病人的生存率紧密相关。 综上所述，本研究揭示了在乳腺癌细胞中CHES1同雌激素信号通路之间存在相互调节的作用，这种作用共同参与ERα介导的转录激活和乳腺癌细胞增殖和成瘤过程。此外，本研究也探究了CHES1在乳腺癌细胞中发挥的生物学功能，为乳腺癌的临床诊断和药物设计奠定了基础。

目录

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摘要

图目录

表目录

缩略词

1 绪论

1．1雌激素受体ERα和乳腺癌

1．1．1 ERα和ERB

1．1．2 ERα和雌激素信号通路

1．1．3 ERα辅调节因子

1．1．4 ERα翻译后修饰

1．1．5 乳腺癌分型和内分泌治疗

1．2 FOX蛋白家族和CHES1

1．2．1 FOX蛋白家族

1．2．2 CHES1简述

1．3立题依据和研究思路

1．3．1立题依据

1．3．2 研究思路

2 CHES1同ERα之间相互作用的研究

2．1 引言

2．2仪器与材料

2．2．1仪器

2．2．2试剂

2．2．3菌种、细胞及质粒

2．3 实验方法

2．3．1溶液配制

2．3．2质粒构建

2．3．3质粒和连接产物的转化

2．3．4质粒提取和鉴定

2．3．5感受态细胞的制备

2．3．6细胞培养

2．3．7细胞转染

2．3．8细胞筛选

2．3．9细胞裂解

2．3．10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．3．11蛋白免疫印迹

2．3．12免疫荧光

2．3．13免疫共沉淀

2．3．14 GST-pulldown

2．4实验结果

2．4．2外源的CHES1同ERα之间的相互作用

2．4．3 CHES1和ERα相互作用区域的确定

2．5讨论

2．6小结

3 CHES1对ERα转录活性的影响

3．1 引言

3．2仪器与材料

3．2．1仪器

3．2．2试剂

3．2．3菌种、细胞及质粒

3．3实验方法

3．3．1溶液配制

3．3．2细胞培养

3．3．3 shCHES1质粒的构建

3．3．4 shCHES1质粒的转化

3．3．5质粒转染

3．3．6荧光素酶报告基因实验

3．3．7逆转录PCR

3．3．8半定量PCR

3．3．9细胞裂解

3．3．10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．3．11蛋白免疫印迹

3．3．12统计学分析

3．4实验结果

3．4．1 CHES1对ERα转录活性的影响

3．4．2 CHES1对ERα下游靶基因表达的影响

3．5讨论

3．6小结

4 CHES 1抑制ERα转录活性的分子机制

4．1 引言

4．2仪器与材料

4．2．1仪器

4．2．2试剂

4．2．3菌种、细胞及质粒

4．3实验方法

4．3．1溶液配制

4．3．2细胞培养

4．3．3细胞转染

4．3．4细胞裂解

4．3．5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

4．3．6蛋白免疫印迹

4．3．7免疫共沉淀

4．3．8荧光素酶报告基因实验

4．3．10 GST-pulldown

4．3．11实时定量PCR

4．3．12核质分离

4．3．13染色质免疫共沉淀

4．3．14 SIRT1酶活测定

4．3．14统计学分析

4．4实验结果

4．4．1 CHES1对ERα蛋白水平的影响

4．4．2 CHES1对ERα二聚化以及亚细胞定位的影响

4．4．3 CHES1对ERα同HDAC1／HDAC2相互作用的影响

4．4．4 CHES1对ERα乙酰化修饰的影响

4．4．5 CHES1对ERα和SIRT1之间相互作用的影响

4．4．6 CHES1同SIRT1存在相互作用

4．4．7 CHES1和SIRT1对ERα转录活性的影响

4．4．8 CHES1对SIRT1酶活的影响

4．5讨论

4．6小结

5 E2-ERα信号通路对CHES1转录表达的影响

5．1 引言

5．2仪器与材料

5．2．1 仪器

5．2．2试剂

5．2．3菌种、细胞、质粒及乳腺癌病人组织

5．3实验方法

5．3．1 溶液配制

5．3．2细胞培养

5．3．3细胞转染

5．3．4细胞裂解

5．3．5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

5．3．6蛋白免疫印迹

5．3．7实时定量PCR

5．3．8染色质免疫共沉淀

5．3．9细胞全基因组DNA的提取

5．3．10 CHES1启动子报告基因质粒的构建

5．3．11 免疫组化

5．3．12生物信息学分析

5．3．13统计学分析

5．4实验结果

5．4．1在乳腺癌细胞中E2-ERα对CHES1表达的影响

5．4．2 E2-ERα调节CHES1表达的分子机制

5．4．3在乳腺癌中CHES1同ERα表达之间的相关性

5．5讨论

5．6小结

6 CHES1对ERα阳性乳腺癌细胞增殖和成瘤能力的影响

6．1 引言

6．2仪器与材料

6．2．1 仪器

6．2．2试剂

6．2．3菌种、细胞、质粒、动物

6．3实验方法

6．3．1溶液配制

6．3．2细胞培养

6．3．6软琼脂克隆形成

6．3．7流式细胞测定细胞周期

6．3．8裸鼠成瘤模型的构建

6．3．9免疫组化

6．3．10生物信息学分析

6．3．11统计学分析

6．4实验结果

6．4．1 CHES1对ERα阳性乳腺癌细胞增殖能力的影响

6．4．2 CHES1对ERα阳性乳腺癌细胞细胞周期的影响

6．4．3 CHES1对ERα阳性乳腺癌细胞成瘤能力的影响

6．4．4 CHES1表达同乳腺癌病人预后的相关性

6．5讨论

6．6小结

7结论与展望

7．1结论

7．2创新点

参考文献

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢